王智輝，鐘媚共，孟子杰，伍婉婷，陳秋旋，鄭 焱，張 鑫△

(1.廣東省江門市中心醫(yī)院腫瘤科 529030；2.廣東省江門市婦幼保健院藥學(xué)部 529000；3.廣東省江門市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心 529030；4.廣東省人乳頭狀瘤病毒(HPV)相關(guān)疾病分子診斷工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東潮州 521021)

乳腺癌(breast cancer)是最常見的女性特發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率居首位，且呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康[1-2]。按浸潤性生長狀態(tài)，可分為原位癌和浸潤癌，并以浸潤性乳腺導(dǎo)管癌(infiltrating ductal carcinoma of breast,IDC)為臨床的主要病理類型[3]。雖然外科手術(shù)依然是治療浸潤性乳腺癌的基礎(chǔ)，但是對于進(jìn)展期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌，化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等的系統(tǒng)治療手段更為重要[4]。然而，有類特殊亞型的乳腺癌——三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的腫瘤生物學(xué)特征更為惡性，且因缺少靶點(diǎn)，無法使用內(nèi)分泌治療藥物及常規(guī)靶向藥物，5年內(nèi)發(fā)生術(shù)后進(jìn)展情況較其他亞型嚴(yán)重[5-6]，是乳腺癌臨床治療中的瓶頸。臨床診治中，TNBC屬排除性分類，為雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性，HER2編碼基因ERBB2無擴(kuò)增的浸潤性乳腺癌[3]。研究指出[3,5,7]，TNBC占全部浸潤性乳腺癌的10%～20%，我國及非洲裔人TNBC的比例較其他國家或種族高。在預(yù)后觀察中，TNBC的特點(diǎn)是有較高的5年內(nèi)進(jìn)展率(約25%)，而較為穩(wěn)定的長期(10～20年)無進(jìn)展率(約70%)[8]，導(dǎo)致部分患者迅速進(jìn)展的機(jī)制依然不清，也少見基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNV)在TNBC惡性進(jìn)展中的作用報(bào)道。因此，本課題組將嘗試?yán)萌蚪MCNV分析結(jié)合臨床樣品驗(yàn)證，找出與TNBC惡性進(jìn)展相關(guān)的基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[9]，下載癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(the cancer genome atlas,TCGA)中乳腺癌的基因組拷貝信息(由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片過濾得到)及對應(yīng)樣品的臨床信息，數(shù)據(jù)庫的更新下載時(shí)間為2020年1月31日。利用臨床信息中ER、PR和HER2的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及ERBB2DNA原位雜交結(jié)果，篩選出ER和PR免疫組織化學(xué)為陰性，同時(shí)HER2免疫組織化學(xué)陰性或ERBB2非擴(kuò)增的TNBC 153例。在GenePattern公共服務(wù)器平臺(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0軟件分析腫瘤組織的全基因組拷貝信息，其中原始拷貝數(shù)信息源自TCGA下載整理，參考基因組為人類19版基因組(human genome 19,hg19)，探針標(biāo)記的物理位點(diǎn)信息(Markers file)和CNV參照信息(CNV file)均整理自SNP Array 6.0的第35版本信息(http://www.affymetrix.com/)；關(guān)鍵的運(yùn)行參數(shù)均為默認(rèn)，并分析X染色體的CNV情況。運(yùn)行所得的關(guān)鍵數(shù)據(jù)：(1)每個(gè)探針標(biāo)記位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失情況，即G評分，G評分的高低能綜合反映該位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失的深度和頻率；(2)每個(gè)樣品中單個(gè)基因的CNV情況，包括缺失、二倍體和擴(kuò)增。

收集整理2012年1月至2015年12月在江門市中心醫(yī)院就診的TNBC患者88例資料，均為手術(shù)標(biāo)本，鑒別診斷參考已發(fā)表文獻(xiàn)及共識。

兩群樣品在性別、年齡、病理類型及TNM臨床分期的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在5年內(nèi)的預(yù)后事件發(fā)生情況上有差異(P<0.001)，原因是TCGA的5年內(nèi)隨訪并不完善，見表1。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院TNBC患者的基本信息

續(xù)表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院TNBC患者的基本信息

1.2 qPCR檢測石蠟標(biāo)本的CDK1基因和MIR892B基因CNV

參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[9]，調(diào)取患者手術(shù)標(biāo)本中腫瘤成分70%的石蠟組織，10 μm厚度切片4張。按GeneRead DNA FFPE試劑盒操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs02504302_cn檢測CDK1基因拷貝數(shù)，引物Hs05702773_cn檢測MIR892B基因拷貝數(shù)，其中內(nèi)參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴(kuò)增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測。規(guī)定樣品中目標(biāo)基因的相對拷貝數(shù)檢測值小于0.75為缺失，大于1.50為擴(kuò)增，其余為二倍體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier分析方法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA中TNBC預(yù)后相關(guān)的擴(kuò)增區(qū)段分析

通過GISTIC 2.0軟件分別對TCGA中27例5年無進(jìn)展和32例5年有進(jìn)展的TNBC患者腫瘤組織進(jìn)行全基因組CNV分析，結(jié)果顯示3p26.1、10q21.2和19q12在有進(jìn)展腫瘤組織中明顯擴(kuò)增，6p21.1、11q13.4和Xq27.3在無進(jìn)展腫瘤組織中明顯擴(kuò)增，見圖1。

2.2 TCGA中TNBC預(yù)后相關(guān)的缺失區(qū)段分析

32例5年有進(jìn)展患者腫瘤組織存在明顯缺失情況的染色體區(qū)段為4p13和12q24.32，在27例5年無進(jìn)展患者腫瘤組織中發(fā)生明顯缺失的為13q22.2和19p13.3，見圖2。

2.3 TCGA中各CNV熱點(diǎn)基因與5年進(jìn)展事件的相關(guān)性

利用IGV軟件并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定各區(qū)段的擴(kuò)增或缺失關(guān)鍵基因：3p26.1為堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員基因E40(BHLHE40)、6p21.1為細(xì)胞周期蛋白D3(CCND3)、10q21.2為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、11q13.4為微小RNA-139(MIR139)、19q12為細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1)、Xq27.3為微小RNA-892B(MIR892B)、4p13為泛素C末端水解酶L1(UCHL1)、12q24.31為跨膜蛋白132B(TMEM132B)、13q22.2為泛素C末端水解酶L3(UCHL3)和19p13.3為絲氨酸/蘇氨酸激酶11(STK11)。只有MIR892B的擴(kuò)增情況能夠在TCGA中顯著區(qū)分TNBC患者的5年無進(jìn)展預(yù)后(χ2=4.300，P=0.038)。進(jìn)一步利用兩兩組合的方式顯示，將MIR892B的非擴(kuò)增或CDK1的擴(kuò)增作為陽性指標(biāo)，能更好地區(qū)分TNBC患者的5年無進(jìn)展預(yù)后(P=0.008)，見表2。

表2 TCGA中各CNV熱點(diǎn)基因與5年內(nèi)進(jìn)展事件的相關(guān)性[n(%)]

2.4 TCGA中CDK1和MIR892B CNV與患者無進(jìn)展預(yù)后的相關(guān)性

將MIR892B的非擴(kuò)增或CDK1的擴(kuò)增患者定義為指標(biāo)陽性組(n=115)，余下的為指標(biāo)陰性組(n=26)，指標(biāo)陽性組的無進(jìn)展預(yù)后要明顯差于指標(biāo)陰性組(P=0.010)，見圖3。

圖3 TCGA中無進(jìn)展預(yù)后曲線圖

2.5 江門市中心醫(yī)院樣品中CDK1和MIR892B CNV與5年進(jìn)展事件的相關(guān)性

在江門市中心醫(yī)院樣品中分別檢測了CDK1和MIR892B的CNV，只有MIR892B的擴(kuò)增情況能夠顯著區(qū)分患者的5年無進(jìn)展預(yù)后(χ2=4.616，P=0.032)，將MIR892B的非擴(kuò)增或CDK1的擴(kuò)增作為陽性指標(biāo)，能更好地區(qū)分TNBC患者的5年無進(jìn)展預(yù)后(P<0.001)，見表3。

表3 CDK1和MIR892B的拷貝數(shù)變異與5年進(jìn)展事件的相關(guān)性[n(%)]

2.6 江門市中心醫(yī)院樣品中CDK1和MIR892B CNV與患者無進(jìn)展預(yù)后的相關(guān)性

在江門市中心醫(yī)院TNBC患者的癌組織中，將MIR892B的非擴(kuò)增或CDK1的擴(kuò)增患者定義為指標(biāo)陽性組(n=68)，余下的為指標(biāo)陰性組(n=20)，指標(biāo)陽性組的無進(jìn)展預(yù)后明顯差于指標(biāo)陰性組(P=0.001)，見圖4。

圖4 江門市中心醫(yī)院樣品中無進(jìn)展預(yù)后曲線圖

3 討 論

近二十年來，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)從概念逐步走到臨床，乳腺癌的診治就是其發(fā)展的范例之一；將分子特征檢測技術(shù)與傳統(tǒng)腫瘤病理診斷相結(jié)合，有力地推動了乳腺癌的精準(zhǔn)診治，成熟的乳腺癌分子特征主要包括了關(guān)鍵驅(qū)動基因的突變、CNV及蛋白產(chǎn)物的異常表達(dá)等。在關(guān)鍵驅(qū)動基因的CNV中，癌基因ERBB2的擴(kuò)增在乳腺癌中最具有臨床意義，一方面，ERBB2的擴(kuò)增是明確的乳腺癌患者不良預(yù)后的標(biāo)志物，是癌蛋白HER2過表達(dá)的主要原因[10]；另一方面，針對HER2蛋白為靶點(diǎn)的曲妥珠單抗，在治療轉(zhuǎn)移性HER2過表達(dá)型乳腺癌中療效確切，能有效延長相適應(yīng)分型患者的生存時(shí)間，而ERBB2的擴(kuò)增檢測是重要的伴隨診斷檢查[11]。但是對于TNBC，暫時(shí)未見可以用于診治的關(guān)鍵驅(qū)動基因CNV特征，探討與TNBC預(yù)后相關(guān)的CNV具有潛在的臨床應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

一般認(rèn)為，腫瘤基因組中發(fā)生擴(kuò)增的區(qū)段一般包含了重要的癌基因，而缺少的區(qū)段則往往含有關(guān)鍵的抑癌基因[12]。利用基因組瀏覽器及文獻(xiàn)調(diào)研，筆者分別確定了各個(gè)區(qū)段的熱點(diǎn)基因，在進(jìn)展組中發(fā)生明顯擴(kuò)增的是與細(xì)胞周期運(yùn)行密切相關(guān)的CDK1(10q21.2)和CCNE1(19q12)[13]，被證實(shí)與乳腺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子BHLHE40(3p26.1)[14]，發(fā)生明顯缺失的有泛素化途徑相關(guān)基因UCHL1(4p13)和跨膜蛋白TMEM132B(12q24.31)；在無進(jìn)展組中發(fā)生明顯擴(kuò)增的是周期相關(guān)蛋白CCND3(6p21.1)和兩個(gè)明確的起抑癌作用的MIR139(11q13.4)[15]、MIR892B(Xq27.3)[16]，發(fā)生明顯缺失的為泛素化途徑相關(guān)基因UCHL3(4p13)和蛋白激酶STK11(19p13.3)。預(yù)后相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，僅MIR892B的非擴(kuò)增與TNBC患者5年進(jìn)展預(yù)后相關(guān)，且MIR892B擴(kuò)增及CDK1非擴(kuò)增的TNBC患者具有好的無進(jìn)展預(yù)后，而這一結(jié)果在江門市中心醫(yī)院樣品中得到了驗(yàn)證，表明了MIR892B的擴(kuò)增是TNBC患者好的預(yù)后相關(guān)因子，而CDK1的擴(kuò)增是TNBC患者差的預(yù)后相關(guān)因子。CDK1作為細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白，在S期與Cyclin A結(jié)合參與細(xì)胞S～G2期轉(zhuǎn)換，在G2期與Cyclin B結(jié)合參與細(xì)胞G2～M期轉(zhuǎn)換，是腫瘤細(xì)胞周期運(yùn)行及增殖的關(guān)鍵蛋白，也是新型抗腫瘤藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)[17]，但是關(guān)于CDK1的CNV在惡性腫瘤中的診斷報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，CDK1的擴(kuò)增能影響TNBC患者預(yù)后，但相關(guān)性較MIR892B的非擴(kuò)增差，提示在TNBC惡性進(jìn)展中MIR892B的作用更明顯。

在前期研究中，筆者率先報(bào)道[16]了miR-892b在乳腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，且其表達(dá)越低患者的臨床分期越高、生存預(yù)后越差；在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，抑制miR-892b能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、皮下成瘤及肺定殖生長，過表達(dá)則起抑制作用，其作用機(jī)制可能與miR-892b能同時(shí)靶向抑制維持NF-κB通路激活的負(fù)調(diào)控因子TRAF2、TAB3和TAK1有關(guān)。前期，筆者觀察到miR-892b編碼基因MIR892B的啟動子位置有甲基化位點(diǎn)，其在乳腺癌中低表達(dá)的原因與啟動子甲基化有關(guān)[16]，而本研究顯示，MIR892B(Xq27.3)在TNBC腫瘤組織中存在擴(kuò)增，而MIR892B(Xq27.3)的擴(kuò)增是與TNBC好的預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步說明了miR-892b的低表達(dá)與乳腺癌特別是TNBC患者差的預(yù)后相關(guān)。近期，在非小細(xì)胞肺癌中筆者觀察到具有抑癌活性的肝性白血病因子(hepatic leukemia factor,HLF)，其低表達(dá)同時(shí)受編碼基因的CNV和啟動子甲基化水平調(diào)控，綜合兩因素的聯(lián)合指標(biāo)更能反映HLF的表達(dá)水平[9]。MIR892B的CNV與啟動子甲基化的聯(lián)合指標(biāo)是否能預(yù)測TNBC患者的預(yù)后是課題組后續(xù)的研究方向。