胡 嵐，王 鶴，王 超，齊文杰

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院感染內(nèi)科 100050)

隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重。噬菌體作為一種可以殺滅細菌的病毒，有著抗生素無法比擬的優(yōu)勢，同時，由于它的生物學特性，對于臨床推廣和應用也有很大的局限。深入的了解噬菌體的特性，以及它在吞噬細菌后對于細菌可能產(chǎn)生的影響，對于將來發(fā)展噬菌體療法以應對泛耐藥細菌的危害有著一定的意義和價值。本研究探討一株泛耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體的分離及其對細菌耐藥性變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本院細菌室保存的一株泛耐藥肺炎克雷伯菌菌株。液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨(英國Thermo Fisher Scientific公司)10 g，酵母提取物(英國Thermo Fisher Scientific公司)5 g，NaCl 10 g，加去離子水(或蒸餾水)至1 L，pH 7.4；0.7%半固體 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉(美國Sigma公司)7 g，加去離子水(或蒸餾水)至 1 L，pH 7.4；1.5%固體 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，加去離子水(或蒸餾水)至 1 L，pH 7.4。將上述培養(yǎng)基配置完畢后送消毒供應室高壓滅菌。SM液：100 mmol/L NaCl，100 mmol/L MgSO4，50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(美國Amresco公司)，pH 7.5，送消毒供應室高壓滅菌。CaCl2，氯仿，聚乙二醇PEG8000(美國Sigma公司)。0.45 μm、0.22 μm生物濾膜(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1菌株的制備

一株泛耐藥肺炎克雷伯菌菌株通過血培養(yǎng)基培養(yǎng)方式進行保留、傳代。無菌條件下劃線法接種在固體LB平板上，經(jīng)過37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑選獨立菌落接種于10 mL的液體LB培養(yǎng)液(或肉湯培養(yǎng)液)中，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長早期，本研究所用菌均為對數(shù)生長早期致病菌。

1.2.2污水標本制備

本院污水處理指定站點留取未經(jīng)處理前的污水3L(2～3次)。加入固體CaCl2至CaCl2的終末濃度為1 mmol/L，10 000 r/min離心20 min，取上清液加入PEG8000至終濃度為10.0%(W/V)，4 ℃冰箱過夜，12 000 r/min離心20 min，沉淀用5 mL噬菌體稀釋液重懸，加入等體積的氯仿，振蕩搖勻30 s，5 000 r/min離心20 min，取上清液先后用0.45 μm、0.22 μm濾膜過濾掉細菌及雜質(zhì)，僅留取小于0.22 μm物質(zhì)包括噬菌體[或?qū)U水14 170×g離心15 min，取上清液通過0.22 μm濾膜濾過細菌，將上清液加入等體積的含有肺炎克雷伯菌的LB培養(yǎng)液中，37 ℃過夜至少12 h，用以擴增噬菌體，次日將培養(yǎng)液加入氯仿(32 μL/mL)萃取，4 ℃ 14 170×g離心15 min]。

1.2.3噬菌體分離

取上述制備完畢的污水100 μL，加入宿主菌(對數(shù)生長期的肺炎克雷伯菌LB液)液體200 μL，混勻后室溫放置15 min，加入47 ℃融化的0.7%瓊脂LB培養(yǎng)基2 mL，混勻后再傾倒于固體LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日觀察噬菌斑的出現(xiàn)情況。對有噬菌斑的，挑取單個噬菌斑，適當稀釋后按上述方法再做噬菌斑形成實驗，重復3次用以純化噬菌體。最后，挑取純化后的單個噬菌斑，接種于5 mL宿主菌中，37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h以擴增噬菌體，10 000 r/min離心20 min，收集上清液以0.22 μm濾膜過濾即得較純的噬菌體液。噬菌體提純，去除內(nèi)毒素，提純前后測定標本中內(nèi)毒素水平。

1.2.4噬菌體滴度測定

將噬菌體液用液體LB培養(yǎng)基10倍連續(xù)稀釋，每稀釋度取100 μL，加入200 μL宿主菌液，然后按上述方法鋪雙層瓊脂平板。滴度(PFU/mL)=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，最終取10次結(jié)果的平均值為其液體滴度。

1.2.5細菌鑒定及耐藥性分析

制備噬菌體完畢后，將制備完畢的噬菌體回種到細菌培養(yǎng)基，證明其活性，觀察噬菌體溶液、細菌菌液、培養(yǎng)液共同培養(yǎng)后的變化，37 ℃過夜保存，當出現(xiàn)由清涼再次變?yōu)闇啙岷?，將細菌菌液在無菌條件下接種到固體LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑選獨立菌株送本院細菌室鑒定細菌及耐藥性分析，對比細菌耐藥性的變化情況。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌耐藥情況

本院一株肺炎克雷伯菌為泛耐藥菌株，噬菌體裂解刺激前藥敏結(jié)果見表1。

表1 肺炎克雷伯菌的噬菌體刺激前后藥敏結(jié)果

2.2 噬菌體φKPN338HL7的分離

本實驗篩選出一株能裂解泛耐藥肺炎克雷伯菌的噬菌體，根據(jù)國際命名規(guī)則將其命名為φKPN338HL7，經(jīng)過3次純化后，雙層LB平板可見清晰、等圓、大小均一、外緣光滑透明、直徑3～4 mm的噬菌斑，見圖1。

圖1 分離得到的噬菌體在雙層LB平板上形成的噬菌斑

2.3 φKPN338HL7滴度測定

根據(jù)不同濃度的噬菌體液與細菌混合后，培養(yǎng)所得的雙層平板結(jié)果顯示本實驗的噬菌體效價約為5×1010pfu/mL，見圖2。

2.4 φKPN338HL7溶原性測定

將1 mL懸液放入2 mL標準凍存管中，置于電動攪拌器上，距離15 W紫外線燈管30 cm以外照射，并將照射后的噬菌體液與細菌液共同培養(yǎng)，并應用單純細菌液做陰性對照、未照射噬菌體與細菌混合液做陽性對照，結(jié)果顯示被照射滅活過的噬菌體無法再形成噬菌斑，與單純細菌液鋪板結(jié)果一致，因此，可以證明該噬菌體為裂解性噬菌體，非溶原性噬菌體。

2.5 φKPN338HL7最佳感染復數(shù)(MOI)測定

本研究所得到的噬菌體以0.001、0.01、0.1、1、2、3、4、6、8的MOI進行感染，結(jié)果顯示φKPN338HL7的MOI=4時所能產(chǎn)生最佳裂解效果，見圖3。

圖3 噬菌體感染復數(shù)結(jié)果

2.6 φKPN338HL7誘導細菌耐藥性變化

細菌在短暫培養(yǎng)液中傳代并不會改變細菌的耐藥性，而經(jīng)過一段時間的噬菌體刺激后，該菌株對于亞胺培南及厄他培南的敏感性有所改變，其他種類的抗生素無明顯變化，見表1。

3 討 論

隨著醫(yī)學不斷地發(fā)展與進步，人們對細菌的認識越來越深入，抗生素的發(fā)明和應用為醫(yī)學帶來巨大的進步。隨著抗生素的廣泛使用，細菌的耐藥性也是不斷地提高，給公共衛(wèi)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)，對于泛耐藥的定義，目前國內(nèi)外基本可以達成一定的共識，認為是對幾乎所有分類的常用抗菌藥物全部耐藥，僅對1～2種抗生素敏感時，稱為泛耐藥[1]。所以在這種情況下，臨床上很難應用有效的藥物對患者進行治療，目前迫切的需要尋找到新的抗生素或者新的治療方法來挽救這些患者的生命。

噬菌體治療細菌感染早已成為可能，有諸多體外實驗提示噬菌體可以有效地對抗細菌，挽救生命[2-5]。噬菌體用于治療細菌感染有很多特點，首先噬菌體是一種病毒，它可以自我的復制、增殖，每一個裂解周期就可以釋放出更多的子代噬菌體，如果噬菌體裂解周期比細菌增殖速度快，那么1個噬菌體就可以消滅它所能識別的所有病原體。同時噬菌體又有非常嚴格的宿主專一性，僅能識別專一的某種或者某類病原體，這既是它的優(yōu)勢也是它的劣勢，優(yōu)勢是它不會對其他的細菌產(chǎn)生任何作用，這樣可以非常有效地保護好機體內(nèi)其他的細菌免受損傷，從而避免了廣譜抗生素常發(fā)生的細菌菌群紊亂，這種高度的專一性使得噬菌體可以進行“靶向”治療[6]。但是這同時也帶來了問題，有時候盡管是同種同屬的細菌，基因型稍有差異，那么噬菌體就有可能不能識別，而恰恰這一點也是限制了噬菌體發(fā)展的重要原因。已有很多關于利用噬菌體治療人類疾病的報道[7-8]，但宿主譜狹窄一直是治療中存在的問題。正因為如此，國內(nèi)外才出現(xiàn)了許多“雞尾酒療法”的研究[9-10]，即將不同的噬菌體混合以提高宿主譜，從而達到有效的治療目的。

噬菌體制劑是目前比較前沿的制劑類型，國內(nèi)并沒有相應的成品及藥品申報，美國亞瑟安德魯醫(yī)學公司(arthurandrew medical lnc.)研制生產(chǎn)的高活性復合噬菌體制劑Floraphge是全球首款復合制劑。另外，一種名叫分枝桿菌Actiphage噬菌體軟膏也被廣泛用于治療結(jié)核性口腔潰瘍。

上海的一些研究所也在采用噬菌體治療耐藥菌，但研究進展緩慢。在國外主要以格魯吉亞等應用最為廣泛，而俄羅斯、英國、美國等也有個案報告。

理論上只要噬菌體生長的速度大于細菌的增殖速度就可能完成對容器內(nèi)所有細菌的殺滅,但實際上很難構(gòu)建一個數(shù)學模型來揭示噬菌體的代謝動力學，TIWARI等[11]的研究表明，噬菌體發(fā)揮作用時要借助中性粒細胞，并在細菌體內(nèi)不斷繁殖裂解，同時超過72 h后噬菌體又會被機體的免疫系統(tǒng)清除，這種巧妙的平衡關系使得給藥時機與傳統(tǒng)抗生素有著本質(zhì)的區(qū)別，因此這種藥代動力學研究起來是非常困難的。

本研究從醫(yī)院處理前污水中成功分離出一株能裂解泛耐藥肺炎克雷伯菌的噬菌體，并將其命名為φKPN338HL7。該噬菌體裂解的空斑清晰透明，這一點符合裂解性噬菌體的特點，其經(jīng)過紫外線誘導照射之后，再進行噬菌斑實驗時，并不能形成有效的噬菌斑，這表明紫外線照射對于噬菌體這類病毒可以起到滅活的作用，同時也證明此次分離得到的噬菌體是非溶原性噬菌體。因此可以通過這種紫外線誘導的方法得到鑒別溶原性與裂解性噬菌體的結(jié)論，溶原性噬菌體相對溫和，因此臨床上意義有限，而裂解性噬菌體其生物學特性比較猛烈，通常條件下可以快速裂解殺滅細菌，為臨床提供治療的可能，本實驗所提取到的噬菌體就屬于此類。此前有研究已經(jīng)證實，除紫外線外，醫(yī)院常用的消毒劑對噬菌體的影響相對小[12]，其對噬菌體的影響率在50%以下，包括84消毒液、雙氧水、苯扎溴銨、石碳酸、戊二醛、碘伏等。噬菌體在某種層面上具有一定的穩(wěn)定性，這也為噬菌體將來可以在臨床廣泛應用提供了一定的支持。

目前噬菌體的提取方法多種多樣，有應用透析膜、冰水冷凝等。本研究發(fā)現(xiàn)，最簡單的實驗方法也可以得到同樣的結(jié)果，同時本研究提供的方法簡單，可操作性好，適合一些基層單位開展。在噬菌體的保存方面，本研究與彭帆等[13]研究的結(jié)果類似，噬菌體的有效保存溫度在-20～4 ℃，而小于-20 ℃保存，則會在半年左右降低噬菌體的裂解活性，降低的速度則是多個指數(shù)等級的。

本研究也觀察到噬菌體與細菌長時間培養(yǎng)，可使渾濁的細菌培養(yǎng)液變清亮后再次變?yōu)闇啙?，接種后不能再形成噬菌斑，提示細菌可能發(fā)生了基因的突變，使得表面的蛋白位點改變，噬菌體不能再對其進行識別，出現(xiàn)了“逃逸”的現(xiàn)象，這種情況屬于噬菌體對細菌外部環(huán)境的選擇結(jié)果，類似于抗生素的選擇，也是細菌強大的適應性表現(xiàn)。但是本研究也顯示，誘導突變的細菌使某些抗生素敏感性發(fā)生一定的變化。這可能提示了細菌在發(fā)生基因突變的同時，某些耐藥基因也被改變，抑或丟失，使得原本無效的藥物可能再次有效，這需要對其進行基因分析。在以后的研究中，有待進一步的研究噬菌體是如何改變耐藥細菌的耐藥性，從而為治療泛耐藥細菌的感染提供一種有效的治療可能。