王永霞,王嬌嬌,黃燕妮,林英姿

(海南醫(yī)學(xué)院教育部熱帶病重點實驗室，?？?571109)

單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)屬于a皰疹病毒科的雙鏈DNA病毒，人群感染普遍，是引起皰疹性口炎、咽峽炎、皮膚復(fù)發(fā)性單純皰疹及皰疹性角膜炎的常見病原體，若累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起單純皰疹病毒性腦炎(herpes simplex viral encephalitis,HSE)，其是該病毒引起的最嚴重病變，占病毒性腦炎的2%～19%。盡管HSV-1和HSV-2均可引起HSE，但94%～96%的患者由HSV-1感染引起[1-2]，未經(jīng)治療的HSE患者病死率高達80%，存活者亦可能遺留不同程度的智力障礙和肢體活動困難等后遺癥[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1顱內(nèi)感染者腦組織中核因子κB(NF-κB)信號通路激活介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與了腦組織病理損傷，可能是病毒包膜糖蛋白與宿主細胞Toll樣受體(TLR)的結(jié)合觸發(fā)了近膜端NF-κB活化的級聯(lián)反應(yīng)，進而激活固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，促進細胞因子、趨化因子及黏附分子的表達，加重了病毒感染后的炎性反應(yīng)[5-6]，因此，抑制其表達可能具有一定的抗病毒作用。

課題組前期從海南紅樹林中分離到一株淡紫擬青霉，其產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)經(jīng)體外實驗證實可通過TLR調(diào)節(jié)HSV-1感染細胞的免疫功能[7]，改善病毒所致的細胞病變效應(yīng)，但該作用是否通過對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)完成有待證實。本研究擬通過顱內(nèi)注射HSV-1建立小鼠感染模型，采用不同劑量的紅樹林淡紫擬青霉EPS經(jīng)腹腔給藥干預(yù)，觀察其對小鼠腦組織NF-κB表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

7周齡健康昆明種小鼠90只，體重18～22 g，SPF級，雄性，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(湘)2014-0011]。

1.1.2主要試劑與儀器

紅樹林淡紫擬青霉EPS由本室制備和鑒定；HSV-1病毒液由本室保存。非洲綠猴腎細胞(Vero 細胞)購自中科院干細胞庫(SCSP-520、CCL-81TM),小鼠NF-κB p65免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；RNA保護液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

生物安全柜(SG403A-HE)購自美國Baker公司；CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AC)購自松下電器有限公司；AE2000倒置生物顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-950E)和高通量組織研磨器均購自寧波新芝生物科技有限公司；高速冷凍離心機購自美國Beckman公司；熒光定量PCR儀購自德國Biometra GmbH公司；全自動凝膠成像分析儀(JY04S-3E)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1病毒滴定

HSV-1于Vero 細胞中傳代2次增加病毒毒力。將收獲的病毒接種于已長成單層的Vero細胞中，逐日觀察細胞病變情況(cytopathic effect，CPE)，當CPE達“+++～++++”時收獲病毒，采用Reed-Muench法滴定其半數(shù)組織感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)為104。本實驗擬用100TCID50病毒接種小鼠。

1.2.2模型建立

將小鼠分為實驗組、藥物對照組、病毒對照組和陰性對照組，實驗組又分為低劑量EPS組、中劑量EPS組、高劑量EPS組，每組15只。戊巴比妥鈉按20 mg/kg腹腔注射，麻醉小鼠，將其固定于實驗臺上，微量注射器于右眼角與外耳道口連線中點處垂直進針，有突破感時停止，進針深度2～3 mm。除陰性對照組外其余組小鼠顱內(nèi)分別注射100TCID50HSV-1 30 μL，陰性對照組注射DMEM 30 μL。次日低、中、高劑量實驗組分別經(jīng)腹腔注射紅樹林淡紫擬青霉EPS 6 g/kg、8 g/kg和10 g/kg，每日2次；藥物對照組注射阿昔洛韋15 mg/kg，每日2次；病毒對照組和陰性對照組注射生理鹽水0.2 mL，每日2次；連續(xù)注射7 d。每日觀察記錄小鼠進食、精神及活動狀況等，對于死亡的小鼠立即開顱取其腦組織，備做免疫組織化學(xué)和RT-qPCR。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色

EPS干預(yù)7 d后處死小鼠，無菌條件下切取左腦腦組織固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；石蠟包埋，制備切片。SABC法進行免疫組織化學(xué)染色，操作嚴格按試劑盒說明書進行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)法修復(fù)抗原，3% H2O2避光孵育15 min，正常山羊血清工作液封閉20 min，NF-κB一抗用兔抗鼠NF-κB p65亞單位的多克隆抗體,稀釋度1∶200，4 ℃孵育過夜，生物素標記的羊抗兔IgG室溫孵育20 min，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素孵育20 min，DAB顯色液顯色1 min，蘇木素復(fù)染。鏡下觀察細胞染色情況，陽性表達定位于細胞核，每張切片400倍下選取15個不重復(fù)的視野，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析NF-κB表達情況。

1.2.4RT-qPCR檢測小鼠腦組織NF-κB mRNA表達

取各組小鼠右側(cè)枕葉腦組織20 mg，預(yù)冷PBS沖洗，立即置于RNA保護液中，腦組織勻漿制備及RNA 提取嚴格按照試劑盒說明書進行。提取完成后分別檢測A260 和 A280，計算RNA 濃度和純度；取各組RNA 5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA完整性。各組RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 NF-κB[8]：上游引物5′-GCA TCC AAC CTG AAA ATC GTG-3′，下游引物5′-CCC CAA ATC CTT CCC AAA CTC-3′ ，由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成；內(nèi)參GAPDH[9]：上游引物5′-TCT TGG GCT ACA CTG AGG AC-3′，下游引物5′-TGT TGC TGT AGC CGT ATT CA -3′。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，SYBR 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，DEPC水6.4 μL，總共20 μL。反應(yīng)條件：93 ℃ 4 min；93 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，△Ct實驗組=Ct實驗組目的基因-Ct實驗組GAPDH，△Ct空白組=Ct空白組目的基因-Ct空白組GAPDH，△△Ct =△Ct實驗組-△Ct空白組，目的基因mRNA相對表達水平以2-△△Ct表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠發(fā)病及死亡情況

除陰性對照組外，接種HSV-1的小鼠次日均出現(xiàn)了精神萎靡、食欲減退、蜷縮、豎毛等癥狀，3～5 d達高峰，病毒對照組、低劑量和中劑量EPS組癥狀最為明顯。病毒對照組小鼠死亡5只(33.3%),低劑量EPS組死亡3只(20.0%)，中劑量、高劑量EPS組和藥物對照組各死亡2只(13.3%)，陰性對照組小鼠無死亡。病毒對照組與陰性對照組小鼠死亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色情況

低劑量EPS組、中劑量EPS組、高劑量EPS組、藥物對照組、病毒對照組、陰性對照組的NF-κB表達水平分別為20.033±3.286、19.594±3.207、15.282±2.395、15.091±2.423、21.962±4.431、14.868±2.490。低劑量EPS組、中劑量EPS組、病毒對照組NF-κB表達與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量EPS組、藥物對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。低劑量、中劑量EPS組與病毒對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高劑量EPS組、藥物對照組與病毒對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量、中劑量EPS組與高劑量EPS組、藥物對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量與中劑量EPS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

A：低劑量EPS組；B：中劑量EPS組;C:高劑量EPS組；D：藥物對照組；E：病毒對照組；F：陰性對照組；紅色箭頭：陽性細胞染色定位于細胞核，根據(jù)染色深淺表現(xiàn)為棕黃至棕褐色。

2.3 RNA純度及完整性檢測

隨機取3份提取的小鼠腦組織RNA，測定其A260及A280，發(fā)現(xiàn)其A260/A280在1.8～2.0，說明RNA純度較高。1%瓊脂糖凝膠電泳可見28 s、18 s、5 s 3條清晰條帶，證明小鼠腦組織RNA完整性好，見圖2。

圖2 小鼠腦組織RNA完整性檢測

2.4 各組小鼠腦組織NF-κB mRNA 表達

低劑量EPS組、中劑量EPS組、高劑量EPS組、藥物對照組、病毒對照組、陰性對照組小鼠腦組織NF-κB mRNA表達水平分別為1.198±0.213、1.135±0.206、0.907±0.165、0.900±0.152、1.250±0.164、0.898±0.188。低劑量、中劑量EPS組、病毒對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高劑量EPS組、藥物對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。低劑量、中劑量EPS組與病毒對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高劑量EPS組、藥物對照組與病毒對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量、中劑量EPS組與高劑量EPS組、藥物對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

目前認為，小膠質(zhì)細胞激活介導(dǎo)的繼發(fā)性免疫損傷在HSV-1顱內(nèi)感染發(fā)病中起著重要作用[10-11]。其中，NF-κB激活介導(dǎo)的炎性反應(yīng)更為關(guān)鍵。HSV-1感染誘導(dǎo)了NF-κB激酶的活化，使NF-κB磷酸化和泛素化，活化的NF-κB游離并轉(zhuǎn)位至細胞核，刺激炎性細胞因子IL-1β、TNF-α及IL-6等的分泌[12-14]。細胞因子的過度分泌介導(dǎo)的劇烈炎性反應(yīng)參與并加重了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫病理損傷，抑制NF-κB激活可能具有一定緩解HSV-1所致炎癥損傷的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)接種病毒的小鼠次日即出現(xiàn)倦怠、蜷縮、抽搐、毛發(fā)紊亂等癥狀，接種后7 d內(nèi)病毒對照組小鼠死亡最多，初步表明EPS具有一定的改善病毒感染小鼠生存的作用。

免疫組織化學(xué)和RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，各劑量EPS對NF-κB表達均有一定抑制作用，其中高劑量EPS組和藥物對照組抑制作用最明顯，而低劑量和中劑量EPS對其表達無明顯抑制作用。以上結(jié)果表明HSV-1引起的小鼠顱內(nèi)感染可導(dǎo)致NF-κB大量激活，紅樹林來源的淡紫擬青霉EPS對其激活具有一定抑制作用，且該作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中高劑量EPS抑制作用明顯，而低劑量和中劑量無明顯抑制作用。

綜上所述，紅樹林淡紫擬青霉EPS對小鼠HSV-1顱內(nèi)感染導(dǎo)致的腦組織NF-κB激活表現(xiàn)出一定抑制作用，這可能是該EPS抗HSV-1感染的機制之一，但其作用是否通過結(jié)合TLR完成還需進一步證實。