白 赫，賴 星，閆 宇

(1.西安醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，西安 710000；2.重慶市潼南區(qū)人民醫(yī)院肝膽甲狀腺乳腺外科 402660；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，西安 710061)

原位肝移植是治療晚期肝病的有效方法，但免疫排斥是肝移植后的關(guān)鍵障礙[1-2]。盡管在肝移植患者中廣泛應(yīng)用免疫抑制劑能明顯改善預(yù)后，但潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)和急性排斥反應(yīng)的發(fā)生仍然是肝移植患者生活質(zhì)量低的主要因素[3]。

Notch通路在肝臟發(fā)揮免疫耐受功能中是必不可少的[3-5]。Notch在多種細(xì)胞類型的多個(gè)階段中起著至關(guān)重要的作用，包括免疫細(xì)胞。哺乳動(dòng)物家族中的Notch蛋白包括4種受體(Notch1～4)和一組包含Jagged(Jag1、2)、Delta樣成員(DLL1、3和4)的配體[6-7]。Notch受體和配體是跨膜蛋白和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域所需的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，這是緊密配體、受體相互作用的結(jié)果。這種細(xì)胞間相互作用導(dǎo)致受體的切割序列由蛋白酶介導(dǎo)，導(dǎo)致Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)釋放到細(xì)胞核中[8-9]。

大量實(shí)驗(yàn)證明[7,10-11]，阻斷Notch1/Jagged1通路可以加強(qiáng)肝臟疾病的炎性反應(yīng)。在Jagged1與Notch1受體結(jié)合后，帶切口的NICD可以被釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并且可以誘導(dǎo)靶基因的激活，分裂Hairy和split-1的增強(qiáng)子(Hes1)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游炎性因子的表達(dá)。這些效應(yīng)與Notch1/Jagged1通路效應(yīng)一致[12]。本研究探討阻斷肝臟Notch1/Jagged1通路對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑

雄性Lewis大鼠60只，BN大鼠60只，5～6周齡，體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

Jagged1、Notch1、P65、p-P65、GAPDH、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；PTEN、AKT、p-AKT、JNK、p-JNK、cleaved-caspase3抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；RNeasy 96試劑盒，PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)DBI公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master MIXPCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；含有針對(duì)SHRNA-SHMT2的純化滴度為1×1012PFU的慢病毒購(gòu)自漢恒生物有限公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司。PCR基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 PCR引物

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及分組

建立大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型。供體手術(shù)：將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后將大鼠固定在消毒后的手術(shù)臺(tái)上，在手術(shù)區(qū)消毒處理。沿腹白線切開，術(shù)中避免腸管損傷。開腹后尋找劍突標(biāo)志物并將其外翻，止血鉗固定皮膚，以徹底暴露手術(shù)視野。無菌濕棉簽將腸管輕刨至腹腔外。剝離膽總管，膽總管支架插入膽總管內(nèi)，進(jìn)一步固定。微量泵將4 °C乳酸林格氏液灌注至肝臟。灌注液從下腔靜脈流出，待肝臟變?yōu)辄S色，取下供肝。整修供肝后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。受體手術(shù)：乙醚吸入麻醉大鼠，將四肢固定于自制的手術(shù)臺(tái)上，消毒處理。開腹后游離肝臟結(jié)扎門靜脈，注入生理鹽水，將肝臟里的血液推進(jìn)全身以保證大鼠不休克，結(jié)扎下腔靜脈，進(jìn)入無肝期。沿肝臟上緣剪斷肝上上腔靜脈。剪斷門靜脈及肝下下腔靜脈，受體取肝結(jié)束。移植供肝：11/0縫線縫合受體肝上下腔靜脈。門靜脈、肝上下腔靜脈套管吻合結(jié)扎固定。結(jié)束無肝期，恢復(fù)灌注后變?yōu)轷r紅色。仔細(xì)檢查是否滲血，膽總管套管套入受體并結(jié)扎固定。溫?zé)嵘睇}水沖洗腹腔，幫助復(fù)溫，關(guān)腹[13-14]。

將大鼠肝移植急性排斥模型分為4組，每組15對(duì)。SHAM組：不做任何處理建立肝缺血再灌注模型；NS組：肝缺血再灌注術(shù)前14 d尾靜脈注射100 μL的生理鹽水作為對(duì)照；shRNA-Jagged1組：肝缺血再灌注術(shù)前14 d尾靜脈注射100 μL 1×1012PFU慢病毒；shRNA-GFP組：肝缺血再灌注術(shù)前14 d尾靜脈注射100 μL 1×1012PFU空載慢病毒。

1.2.2肝功能檢測(cè)

各組大鼠取血800 μL，1 200×g離心10 min，分離上層血清，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBiL)水平。

1.2.3PCR檢測(cè)肝組織Jagged1、Notch1 mRNA表達(dá)

采用RNeasy 96試劑盒分別提取各組肝組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按照說明書步驟操作。取樣本cDNA，加入SYBR GreenⅠ進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次。

1.2.4Western blot 檢測(cè)Jagged1、Notch1、p-JNK、cleaved-caspase3等蛋白表達(dá)

將收集的各組大鼠肝組織剪碎，加入RIPA裂解液裂解組織，勻漿器研磨。按照碧云天蛋白質(zhì)提取說明書提取總蛋白。將提取好的各組蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h，轉(zhuǎn)膜2 h，封閉1 h后加入一抗過夜，24 h后TBST洗滌3次,加入對(duì)應(yīng)的二抗常溫孵育1 h。TBST洗滌3次，加入顯影液拍照。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)

取標(biāo)本冰凍切片，PBS洗片5 min×3次。消除非特異性背景染色：滴加正常山羊血清封閉液(PBS稀釋)室溫封閉20 min后甩去液體，PBS洗片5 min×3次。滴加一抗于4 ℃條件下過夜，37 ℃復(fù)溫30 min或37 ℃孵育1 h,PBS洗片5 min×3次。滴加熒光素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育60 min。PBS洗片5 min×3次?？篃晒獯銣鐒┓馄?，鏡檢。

1.2.6TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡水平

新制備的4%多聚甲醛溶液固定，室溫30 min。細(xì)胞的通透：PBS洗片，與通透液在冰浴中孵育2 min。標(biāo)記：PBS沖洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37 ℃孵育60 min。PBS沖洗3次。信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析：加入50 μL轉(zhuǎn)化劑POD，在濕盒中37 ℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入50～100 μL DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。封片，在熒光鏡下分析結(jié)果。在顯微鏡下，觀察各組細(xì)胞核染色的情況，以細(xì)胞核呈棕色為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，評(píng)估各組肝細(xì)胞凋亡水平。

1.2.7ELISA檢測(cè)IL-1、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β水平

根據(jù)試劑盒產(chǎn)品說明檢測(cè)肝勻漿或上清液中炎癥細(xì)胞因子的水平。0.05 mol/L pH 9的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，PBS洗3 min×3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h，洗滌。各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1.0 h，洗滌。加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃孵育10～30 min。加入2 mol/L硫酸0.05 mL。于450 nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零后檢測(cè)各孔吸光度(A)值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照A值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

1.2.8肝組織病理檢查

取移植肝組織放入10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm厚切片，脫蠟、脫水，HE染色，100倍光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病變情況；根據(jù)Banff等制訂的急性排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝移植后Notch1、Jagged1的表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)顯示，在肝缺血再灌注后Notch1、Jagged1的蛋白表達(dá)明顯升高，并在24 h達(dá)到最大值(P<0.05)，見圖1A～C。在同一時(shí)段采用PCR檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)Notch1、Jagged1 mRNA表達(dá)的升高趨勢(shì)與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致，見圖1D、E。由于在24 h時(shí)升高最明顯，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用缺血再灌注24 h為實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。

A～C：Western blot檢測(cè)；D、E：PCR檢測(cè)。

2.2 慢病毒沉默Jagged1后蛋白及mRNA表達(dá)變化

PCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)shRNA-Jagged1組Jagged1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖2A～C。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，shRNA-Jagged1組Jagged1熒光表達(dá)明顯降低，慢病毒沉默Jagged1成功，效果明顯，見圖2D。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A～C：Western blot檢測(cè)；D：免疫熒光檢測(cè)(×100)。

2.3 各組大鼠肝移植后24 h肝功能水平變化

shRNA-Jagged1組AST、ALT、TBiL水平明顯高于NS組和shRNA-GFP組(P<0.05)，見圖3。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 各組大鼠肝移植后24 h肝功能水平變化

2.4 各組大鼠肝組織病理變化及排斥反應(yīng)評(píng)分

光鏡下觀察到shRNA-Jagged1組出現(xiàn)大量肝細(xì)胞空泡樣變，結(jié)構(gòu)損傷，肝血竇堵塞等，較NS組的肝臟損傷更嚴(yán)重，見圖4A。shRNA-Jagged1組的肝移植排斥反應(yīng)評(píng)分明顯高于NS組(P<0.05),見圖4B。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：HE染色(×100)；B：排斥反應(yīng)評(píng)分。

2.5 各組大鼠凋亡細(xì)胞及p-JNK、cleaved-caspase3表達(dá)情況

shRNA-Jagged1組較NS組、shRNA-GFP組可見更多的棕黃色染色的凋亡細(xì)胞(P<0.05)，見圖5A、B。shRNA-Jagged1組p-JNK、cleaved-caspase3表達(dá)較NS組明顯升高(P<0.05)，見圖5C、D。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A、B：TUNEL法檢測(cè)(×200)；C、D：Western blot檢測(cè)。

2.6 各組大鼠血清中炎性因子水平及肝臟調(diào)解炎癥的通路

shRNA-Jagged1組IL-1、IL-6表達(dá)明顯高于NS組，IL-10、TGF-β明顯低于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6A～D。與NS組比較，shRNA-Jagged1組中PTEN、p-P65表達(dá)明顯升高，p-AKT表達(dá)明顯下降，IL-6、IL-1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6E、F。NS組及shRNA-GFP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A～D：炎性因子；E、F：肝臟調(diào)解炎癥的通路。

3 討 論

Notch通路在進(jìn)化上是相對(duì)保守的，并且在組織的發(fā)育和更新期間調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活性中起關(guān)鍵作用[15-16]。NICD通過CSL依賴性和獨(dú)立通路調(diào)節(jié)其下游靶基因[17]。Notch1/Jagged1通路已被確認(rèn)在干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

肝移植排斥導(dǎo)致的炎癥可歸因于肝臟內(nèi)各種細(xì)胞產(chǎn)生的先天免疫應(yīng)答，本研究結(jié)果顯示，肝移植排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)Notch1、Jagged1的表達(dá)增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，Notch1/Jagged1通路的機(jī)制可能參與免疫通路的激活[18-19]。Notch1/Jagged1通路已被證明是控制免疫細(xì)胞發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)因子[19]。PTEN負(fù)調(diào)節(jié)磷酸鈣-3,4,5-三磷酸鈣的細(xì)胞內(nèi)水平，并通過負(fù)調(diào)節(jié)AKT/PKT通路激活腫瘤抑制因子[20]。在大鼠急性肝移植排斥期間，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的PTEN已被證明可調(diào)節(jié)急性炎性反應(yīng)和內(nèi)毒素致死率。在肝移植排斥反應(yīng)發(fā)生后，shRNA-Jagged1組中抑制p-AKT活化的PTEN增加。PTEN還可以通過先天免疫細(xì)胞主動(dòng)釋放和促進(jìn)KCs的先天免疫反應(yīng)，提示其作為內(nèi)源性風(fēng)險(xiǎn)信號(hào)或警報(bào)的作用可能涉及不同的受體，包括TLR2、TLR4和高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，這觸發(fā)了一系列炎性反應(yīng)[21-22]。核因子(NF)-κB家族中的蛋白質(zhì)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并在炎癥調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用。通過p-AKT的減少，shRNA-Jagged1組中的TLR4明顯活化。TLR通路通過髓樣分化初級(jí)應(yīng)答88-或含有toll-interleukin受體結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)IFN-β依賴性通路促進(jìn)先天免疫應(yīng)答的激活，這些通路有助于下游NF-κB活化和隨后的炎性反應(yīng)。本研究顯示，阻斷肝臟中Notch1/Jagged1通路增加了P65的磷酸化，這是NF-κB通路的關(guān)鍵蛋白[15,23]。同時(shí)阻斷Notch1/Jagged1通路可激活NF-κB通路，加重肝移植急性排斥反應(yīng)誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，其具體表現(xiàn)為shRNA-Jagged1組中促炎因子IL-1、IL-6表達(dá)明顯高于NS組。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝移植急性排斥反應(yīng)上調(diào)肝臟中Notch1、Jagged1表達(dá)，阻斷Notch1/Jagged1通路通過PTEN/AKT/TLR4軸導(dǎo)致TLR4激活增強(qiáng)，直接引起肝臟內(nèi)炎性因子的增加。HE染色和肝功能檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明Notch1/Jagged1通路的阻斷或KCs的加重，破壞了肝臟結(jié)構(gòu)組織和肝功能。提示阻斷Notch1/Jagged1通路可能通過PTEN/AKT/TLR4對(duì)肝移植急性排斥反應(yīng)發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞凋亡已被證明在肝移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[24-25]。JNK對(duì)于caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，有研究證實(shí)通過TLR4/JNK/NF-κB通路可以響應(yīng)肝移植的急性排斥反應(yīng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA-Jagged1抑制Jagged1表達(dá)阻斷Notch1/Jagged1通路，可以促進(jìn)JNK信號(hào)激活，從而介導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生。提示Notch1/Jagged1通路在其介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中控制JNK活化。同時(shí)shRNA-Jagged1對(duì)Notch1/Jagged1通路的阻斷增加了JNK的磷酸化，并增加了肝移植急性排斥反應(yīng)中裂解的caspase3。TUNEL實(shí)驗(yàn)為肝移植急性排斥反應(yīng)中凋亡細(xì)胞的明顯增加提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究證明了Notch1/Jagged1通路可能通過PTEN/AKT/TLR4軸在肝移植急性排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。阻斷Notch1/Jagged1通路增加了p-JNK和cleaved-caspase3表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重了肝移植急性排斥反應(yīng)。因此，調(diào)節(jié)Notch1/Jagged1通路的治療可能是治療急性排斥反應(yīng)并改善接受肝同種異體移植物的大鼠存活率的有效策略。