舒靖能，廖玉華，盛衛(wèi)星(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司 ，浙江 金華 321016)

0 引言

阿米卡星，化學(xué)名稱為O-3-氨基-3-脫氧-a-D-葡吡喃糖基-(1→6)-O-[6-氨基-6-脫氧-a-D-葡吡喃糖基-(1→4)]-N-(4-氨基-2-羥基-1-氧丁基)-2-脫氧-D-鏈霉胺，為半合成氨基糖甙類抗生素，以卡那霉素為起始物料合成而來。其作用機(jī)制是作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，致使細(xì)菌細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞死亡，主要依靠于細(xì)菌30S亞基結(jié)合，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而起到抗菌作用，適用于革蘭陰性桿菌和對(duì)青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌引起的感染。目前臨床上應(yīng)用比較廣泛，有著很好的市場前景。隨著一致性評(píng)價(jià)持續(xù)進(jìn)行，客戶的需求不斷提升，而且中國藥典及各國藥典的升版，對(duì)阿米卡星的質(zhì)量要求越來越高。在2020年版《中國藥典》中阿米卡星的雜質(zhì)包含：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I等，雜質(zhì)種類繁多，對(duì)雜質(zhì)控制要求較高。阿米卡星作為本公司的拳頭產(chǎn)品，在國內(nèi)外市場均有銷售，產(chǎn)量大、效益好，占有較大的市場份額，對(duì)于雜質(zhì)的研究就非常有必要。通過雜質(zhì)研究能夠?qū)Ξa(chǎn)品帶來較大的幫助，一方面可以減少雜質(zhì)產(chǎn)生，提升質(zhì)量，另一方面，反應(yīng)過程雜質(zhì)合成減少以后又能增加收率，降低生產(chǎn)成本。本次我們著重對(duì)雜質(zhì)E進(jìn)行研究，試圖找到雜質(zhì)E的形成條件并進(jìn)行雜質(zhì)控制。

1 檢測方法的建立

1.1 衍生化后的HPLC法

衍生化處理過程中使用到的衍生劑2,4,6-三硝基苯磺酸的實(shí)驗(yàn)操作安全性影響較大；衍生化法干擾因素多，如不同廠家的試劑有明顯差異，致使部分雜質(zhì)的結(jié)果重現(xiàn)性差，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的全面控制，且衍生需要的時(shí)間較長。

1.2 薄層層析(TCL)方法

工藝中控方法采用TCL進(jìn)行監(jiān)控，雜質(zhì)的分離度不夠，所監(jiān)控的雜質(zhì)有限，不能監(jiān)控工藝中所涉及的大量雜質(zhì)，中間生產(chǎn)過程不能有效的進(jìn)行監(jiān)控。為了改變目前中控手段的短板，擬對(duì)藥典方法進(jìn)行借鑒，建立中控檢測方法。目前在使用的阿米卡星藥典方法有歐洲藥典電化學(xué)方法和中國藥典末端吸收方法。但由于歐洲藥典的有關(guān)物質(zhì)檢測方法采用電化學(xué)檢測器，該檢測器使用金電極，金電極比較脆弱，一般適合于純度較高的成品檢測，不適合對(duì)產(chǎn)品的中間控制。故最終采用中國藥典的末端吸收方法來進(jìn)行檢測與有關(guān)物質(zhì)的控制，該法具有檢測樣品處理簡單、檢測時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

分析方法的建立：

供試品溶液：取本品適量，加流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 000 u單位的溶液，作為供試品溶液；

對(duì)照溶液：精密量取適量，用流動(dòng)相A稀釋制成每1 mL中約含0.05 mg的溶液，作為對(duì)照溶液；

色譜條件：按照本公司高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程試驗(yàn)，引用2020年版中國藥典二部的規(guī)定[1]。

按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Ru為供試品峰面積；Rs為對(duì)照品峰面積。

并對(duì)專屬性、精密度、定量限、檢測限等方面進(jìn)行了確認(rèn)。

在完成過程檢測方法優(yōu)化后，著重對(duì)阿米卡星雜質(zhì)E進(jìn)行了研究。

2 阿米卡星雜質(zhì)E形成條件探討及合成條件控制

2.1 阿米卡星雜質(zhì)E形成條件

目前阿米卡星生產(chǎn)工藝常采用卡那霉素經(jīng)過硅烷化保護(hù)氨基后與PHBA活性酯?；瘉碇苽洌俳?jīng)過水解、肼解、過柱、結(jié)晶得到。其中硅烷化的合成路線如圖2所示下[2]。

圖2 硅烷化的合成路線

雜質(zhì)E為阿米卡星的雜質(zhì)之一，根據(jù)藥典雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析為卡那霉素的6′位的氨基加上了AHBA側(cè)鏈。而卡那霉素分子中有4個(gè)氨基分別為1，3，6′，3″四個(gè)位置的氨基，每個(gè)氨基都可參與反應(yīng)，這些氨基未進(jìn)行保護(hù)而直接與活性酯反應(yīng)時(shí)，6′位的氨基反應(yīng)活性最大，但這不是需要的產(chǎn)物。因此需要改變氨基的活性，讓1位的活性最大，最大量的生成阿米卡星。因此通過硅烷化保護(hù)反應(yīng)后，1位上的氨基活性最強(qiáng)，6′位變成最弱，合成產(chǎn)物以阿米卡星為主。對(duì)生產(chǎn)過程中的肼解后濾液進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)E含量平均達(dá)到了3.5%，雜質(zhì)水平偏高，通過前述合成路線分析認(rèn)為硅烷化保護(hù)程度影響雜質(zhì)水平。為此，我們將通過開展一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索確認(rèn)影響雜質(zhì)E的合成條件，并找到最佳反應(yīng)條件進(jìn)行雜質(zhì)控制。

2.2 雜質(zhì)合成條件控制

合成路線：將一定量的卡那霉素投入無水乙腈中，加入六甲基二硅烷胺，再加入三甲基后升溫，到達(dá)回流溫度，回流一定的時(shí)間后結(jié)束降溫，再經(jīng)過?；?、水解、肼解。從合成路線中我們分析得到兩個(gè)主要影響因素，六甲基二硅烷胺的量及回流反應(yīng)時(shí)間，這兩個(gè)因素影響著硅烷化對(duì)氨基的保護(hù)程度，下面就這兩個(gè)因素開展以下實(shí)驗(yàn)：

2.2.1 實(shí)驗(yàn)部分

(1)六甲基二硅烷胺的使用量

在四口燒瓶加入300 mL無水乙腈，投入46.0 g卡那霉素(分子量為484.5，94.94 mmol)，加入六甲基二硅烷胺(分子量為161.39)，再加入10 g三甲基氯硅烷后升溫，到達(dá)回流溫度后回流1.5 h。針對(duì)六甲基的使用量，設(shè)置了摩爾比1∶0、1∶2、1∶5.5、1∶6.5、1∶7.5等5種情況，做到肼解后濾液(上柱分離前中間體)結(jié)果如表1所示。

表1 六甲基二硅烷胺量的影響

從表中可以看出卡那霉素與六甲基二硅烷胺摩爾比1∶6.5時(shí)，雜質(zhì)E的含量已經(jīng)最低，是最佳條件之一。把這個(gè)因素固定后，又對(duì)回流反應(yīng)時(shí)間開展實(shí)驗(yàn)。

(2)硅烷化回流反應(yīng)時(shí)間

設(shè)置了回流時(shí)間2、4、6、8 h四種情況，做到肼解后濾液(上柱分離前中間體)，結(jié)果如表2所示。

表2 硅烷化回流反應(yīng)時(shí)間的影響

從表2可以看出回流時(shí)間為4.5 h時(shí)，雜質(zhì)E的含量最低，是最佳條件之一。

2.2.2 合成控制小結(jié)

通過六甲基二硅烷胺的使用量量及硅烷化反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)條件的探索，發(fā)現(xiàn)卡那霉素與六甲基摩爾比在1∶6.5，反應(yīng)時(shí)間在4.5 h為最佳，雜質(zhì)E的含量最低在1%左右，而我們的收率也最高，達(dá)到了61.5%，收率提升了2.5%左右。

2.3 雜質(zhì)E的柱層析控制

通過柱層析分離對(duì)合成料液進(jìn)行分離，達(dá)到純化的目的。柱層析是一個(gè)雜質(zhì)分離過程，主要是通過樹脂上柱吸附和解析劑洗脫達(dá)到分離的效果來去除料液中的未反應(yīng)的卡那霉素及其他雜質(zhì)如雜質(zhì)E。由于柱層析的周期長，對(duì)過程的控制尤為重要。建立前述的中控檢測方法以后，對(duì)雜質(zhì)E的解析過程進(jìn)行了有效監(jiān)控，雜質(zhì)E得到有效控制。通過這樣的控制雜質(zhì)E控制在0.1%以內(nèi)，達(dá)到了較好的分離效果。

3 結(jié)語

本次研究首先建立了阿米卡星中間體的中控方法，該方法具有樣品處理簡單、檢測時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。其次對(duì)雜質(zhì)E形成條件進(jìn)行探討，并利用中控方法，對(duì)合成條件進(jìn)行研究，確立了最佳的合成條件。再次對(duì)柱層析過程加強(qiáng)控制，控制雜質(zhì)E在0.1%以內(nèi)。通過本次研究，一方面提升了合成步驟的收率，提升2.5%，另一方面有效降低了雜質(zhì)E的含量，為柱層析減輕壓力，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，取得了比較理想的成果。