王曉晗 韓 豐 沈 亮 陳云清 沈月玉 高 晨 侯震濤 冀子中 范竹萍

肝星狀細胞(HSC)活化被認為是肝纖維發(fā)生的關鍵[1]。HSC的活化過程包括早期的啟動激活和后期的持續(xù)性激活，短時間的肝損傷可引起HSC的啟動激活，而慢性炎性反應是HSC持續(xù)激活的基礎[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)脂質(zhì)沉積引起的氧化應激等脂毒性表現(xiàn)與肝纖維化進展有關[3]。A20作為調(diào)控炎性反應的一種重要蛋白，在炎性反應激活后可被誘導表達，其對炎性反應的調(diào)控作用已被深入研究[2,4-6]。本研究主要探究A20、主要組織相容性復合物Ⅰ類鏈相關基因A(MⅠCA)、MⅠCB在脂肪變HSC中的表達及作用。

1 材料與方法

1.1 脂肪變HSC的制備

取油酸(不飽和脂肪酸)和軟脂酸(飽和脂肪酸)比例為2∶1的混合脂肪酸(FFA)，配置物質(zhì)的量濃度為0.5 mmol/L，實驗組采用FFA刺激人HSC LX-2細胞(購自ATCC)24 h，以誘導其發(fā)生脂肪變，對照組不予FFA刺激，留取細胞備用。

1.2 油紅O染色

FFA作用于LX-2細胞24 h后，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS漂洗。加入4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水洗滌。油紅O液浸染30 min，顯微鏡下觀察染色情況。蒸餾水洗滌，60%乙醇浸洗細胞5～10 s。蒸餾水洗滌，蘇木素染液浸染20 s，水洗，干片，拍照。

1.3 RNA分離及實時熒光定量PCR

取實驗組和對照組LX-2細胞，漂洗后加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min)，實時熒光定量PCR(real-time qPCR)法分析A20、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅲ型膠原、MⅠCA、MⅠCB的mRNA表達?？偡磻w系共10 μL，步驟為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。所有實驗均重復3次。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理

應用Graph pad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪變LX-2細胞的制備

LX-2細胞呈梭形或多邊形，實驗組LX-2細胞采用FFA刺激24 h后，油紅O染色示細胞質(zhì)內(nèi)有明顯的紅色脂質(zhì)顆粒沉積，而未予FFA刺激的對照組LX-2細胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒明顯少于實驗組細胞。見圖1。

圖1 兩組LX-2細胞 油紅O染色 ×100 A 對照組 B 實驗組

2.2 兩組LX-2細胞中α-SMA、Ⅲ型膠原的mRNA表達水平比較

real-time qPCR法檢測結(jié)果顯示，實驗組LX-2細胞中α-SMA、Ⅲ型膠原的mRNA表達水平(1.53±0.18，2.40±0.81)均較對照組明顯升高，分別為對照組的1.53倍、2.40倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.035，P=0.041)。見圖2。

2.3 兩組LX-2細胞中A20的mRNA表達水平比較

real-time qPCR法檢測結(jié)果顯示，實驗組LX-2細胞中A20 mRNA的表達水平(3.32±0.67)較對照組明顯升高，為對照組的3.32倍，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)。見圖3。

注：*P<0.05

注：*P<0.05

2.4 兩組LX-2細胞中MⅠCA、MⅠCB的mRNA表達水平比較

real-time qPCR法檢測結(jié)果顯示，實驗組LX-2細胞中MⅠCA、MⅠCB的mRNA表達水平(3.09±1.30，16.50±2.47)均較對照組明顯升高，分別為對照組的3.09倍、16.50倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.049，P=0.008)。見圖4。

注：*P<0.05；**P<0.01

3 討論

肝纖維化的特征是纖維結(jié)締組織的過量形成和沉積，導致進行性組織重塑。目前已知遺傳性疾病、慢性病毒感染、乙醇濫用、自身免疫性疾病、代謝紊亂、膽汁淤積、膽汁酸成分或水平的改變、靜脈阻塞和寄生蟲感染都是導致肝纖維化的因素。此外，過量的脂肪和其他脂肪毒性介質(zhì)引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體功能改變、氧化應激及腸道菌群改變均與非酒精性脂肪性肝病相關，可促使肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪變HSC中α-SMA、Ⅲ型膠原的mRNA表達水平升高。過量脂肪酸攝取誘導的氧化應激可引起肝損傷和炎性免疫細胞的持續(xù)募集，引起肝纖維化，從而促進單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)進展[8]。

A20作為一種泛素修飾酶，在炎性反應的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[9-10]。本課題組的前期研究表明，在肝細胞和巨噬細胞中，過表達A20可抑制炎性反應和減輕細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；敲除A20后肝細胞和巨噬細胞內(nèi)炎性反應加重、脂質(zhì)沉積增加[5-6]。而對于A20在HSC脂質(zhì)沉積中的作用的研究較少。有研究顯示，高脂飲食誘導的小鼠心臟損傷模型中，A20能改善小鼠的脂質(zhì)累積、氧化應激、炎性反應、細胞凋亡，以及心肌肥厚、纖維化和心功能障礙[11]。另有研究表明，A20在肝臟保護中起關鍵作用，包括抑制肝損傷后的炎性反應，刺激肝細胞生長，防止肝臟缺血再灌注損傷[12]。在白色脂肪組織中，A20是脂聯(lián)素抗炎作用的中介物質(zhì)，是減輕肥胖相關病理的潛在靶點[13]。A20蛋白的高表達可能成為預防NASH進展的潛在治療策略[6]。脂肪酸、腸源性內(nèi)毒素等物質(zhì)可通過與HSC的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合誘導炎性反應發(fā)生，炎性反應發(fā)生時，循環(huán)中TNF-α、IL-1β等炎性因子和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等趨化因子水平明顯升高，這些細胞因子可通過持續(xù)性激活HSC產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，參與肝纖維化的形成。本研究中，F(xiàn)FA引起的脂肪變HSC中A20 mRNA表達升高，具體機制有待進一步探索。

有研究發(fā)現(xiàn)MⅠCA和MⅠCB水平在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者中升高，推測其可能在炎性反應局部發(fā)揮作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)MⅠCA、MⅠCBmRNA在脂肪變HSC中表達升高，其在肝纖維化中的作用有待進一步研究闡明。MⅠCA和MⅠCB作為NK細胞2家族成員D(NKG2D)受體的配體，在肝臟炎性反應過程中，在HSC對NK細胞的易感性中起重要作用[15]。在藥物性肝損傷研究中，人原代肝細胞中MⅠCA、MⅠCB在多種藥物作用下表達升高[16]。在原發(fā)性肝癌細胞中，通過上調(diào)MⅠCA和MⅠCB表達，從而促進了肝癌細胞被NK細胞識別和清除，其可作為新型免疫治療藥物的研發(fā)方向[17]。

綜上所述，在脂肪變HSC中，A20、MⅠCA、MⅠCB的表達水平升高，可能在肝纖維化過程中發(fā)揮協(xié)同作用，具體機制還有待進一步研究闡明。