賈小霞，齊恩芳，劉 石，黃 偉，呂和平，文國(guó)宏，馬 勝

（1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，蘭州730070；2甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州730070；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅渭源748201）

0 引言

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推進(jìn)，馬鈴薯種植面積日益增加[1]。然而，在馬鈴薯生產(chǎn)中，病毒病的普遍發(fā)生導(dǎo)致馬鈴薯的產(chǎn)量降低和商品性狀退化，而且隨著種植年限的增加逐年加重，嚴(yán)重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展[2-3]。馬鈴薯脫毒種薯的繁育和推廣可以從根本上抑制病毒病的發(fā)生和蔓延，是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要保障[4-5]，脫毒試管苗的擴(kuò)繁是脫毒種薯繁育的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[6-7]，培養(yǎng)基是脫毒試管苗生產(chǎn)的基礎(chǔ)[8]。目前，馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)試管苗快繁大多采用MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分是影響試管苗生長(zhǎng)的重要因素，不同品種對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需求也有差異[9]?！M(fèi)烏瑞它’較適應(yīng)含高氮、磷、鉀的MS培養(yǎng)基，‘中薯3號(hào)’較適應(yīng)常規(guī)含量的MS培養(yǎng)基[10]，‘新大坪’在含9 mmol/L氯化鈣的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)最佳[11]，‘克新13號(hào)’和‘克新1號(hào)’在僅含大量元素的MS培養(yǎng)基上葉大色綠，株高和莖粗均與常規(guī)培養(yǎng)基上的脫毒苗無(wú)顯著差異[12]，生長(zhǎng)在缺P(pán)培養(yǎng)基上的‘鄂馬鈴薯3號(hào)’脫毒苗的植株生長(zhǎng)形態(tài)、生物產(chǎn)量均較缺N高[13]。在保證高質(zhì)量的前提下，降低成本有利于脫毒種苗與種薯的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，不添加有機(jī)物（包括肌醇）的MS培養(yǎng)基與全量添加的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的試管苗的農(nóng)藝性狀基本一致[14]，本課題組的長(zhǎng)期生產(chǎn)試驗(yàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，為了節(jié)省成本，生產(chǎn)中大都用不添加有機(jī)物的MS培養(yǎng)基替代全量添加的MS培養(yǎng)基?？梢钥闯觯瑸榱斯?jié)省成本和簡(jiǎn)化試驗(yàn)，前人做了大量研究，但不同品種對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需求存在較大差異?！]薯7號(hào)’因?yàn)槠淇共?、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、廣適的特點(diǎn)，被農(nóng)業(yè)部確定為2014年主導(dǎo)品種，不僅在甘肅省每年種植面積超過(guò)13.33萬(wàn)hm2，在陜西、寧夏和青海等其他西北地區(qū)也有大面積種植[15]，近幾年在廣東、廣西、福建等南方冬作區(qū)也有較大面積的種植[16]?！]薯20號(hào)’是具有抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等特性的早熟新品種，具有很好的應(yīng)用前景，篩選這2個(gè)品種脫毒苗快繁的最佳培養(yǎng)基，是滿足全國(guó)脫毒種薯全覆蓋的重要基礎(chǔ)，但關(guān)于這2個(gè)品種培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)?zāi)壳吧形匆?jiàn)報(bào)道。因此，本研究以‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’脫毒試管苗為試驗(yàn)材料，以MS為基本培養(yǎng)基，研究缺鈣、鐵和微量元素對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響，旨在篩選‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’脫毒苗高效低成本快繁培養(yǎng)基的同時(shí)，為馬鈴薯脫毒苗快繁生產(chǎn)中培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料馬鈴薯栽培品種‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’，為甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室繼代培養(yǎng)的脫毒苗，每25～30天在MS培養(yǎng)基上繼代繁殖1次，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強(qiáng)度為2000～2500 lx，光照周期為16 h/d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別設(shè)含MS培養(yǎng)基不同成分的培養(yǎng)基8組，培養(yǎng)基成分見(jiàn)表1。所有處理均添加4.5 g/L瓊脂，30 g/L白糖，調(diào)節(jié)pH 5.8～6.0。在無(wú)菌條件下，選取生長(zhǎng)健壯的馬鈴薯試管苗，切成帶1個(gè)腋芽的莖段，接種到上述8種培養(yǎng)基中，每瓶接10株，每個(gè)處理12瓶，3次重復(fù)。接種后將培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)室，在23±2℃、光照周期為16 h/d的條件下培養(yǎng)，第30天時(shí)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)于2020年2—8月份在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所組織培養(yǎng)室進(jìn)行。

表1 培養(yǎng)基

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目 試管苗培養(yǎng)30天時(shí)進(jìn)行取樣調(diào)查，每個(gè)處理隨機(jī)抽取3瓶，測(cè)定株高(cm)、活葉數(shù)（片/株）、莖粗(mm)、植株鮮重(mg/株)、植株干重(mg/株)。采用直尺測(cè)量植株株高（植株莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的高度，cm）；采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量莖基部的直徑即為莖粗(mm)、根莖葉干重(mg)采用烘干法測(cè)定，即測(cè)完鮮重(mg)后，于105℃殺青30 min后，80℃烘干至恒重。

葉綠素含量的測(cè)定：取新鮮的試管苗0.25 g，加入少量CaCO3和石英砂，加入1 mL 80%的丙酮研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，再用5～8 mL 80%的丙酮洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管，在避光環(huán)境下靜置數(shù)小時(shí)，待組織變白后進(jìn)行離心，離心后棄沉淀，上清液用80%的丙酮定容到10 mL后，使用UV-5800型紫外分光光度計(jì)測(cè)定663 nm和645 nm處的OD值，以80%的丙酮調(diào)零。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理采用Microsoft Excel 2010；單因素方差(One-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS V3.01軟件；差異顯著性采用Duncan’s法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺微量元素對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，2號(hào)培養(yǎng)基缺微量元素。接種13天時(shí)，兩品種在1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常；培養(yǎng)30天時(shí)，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常，‘隴薯7號(hào)’的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無(wú)顯著差異（表2和圖3）；‘隴薯20號(hào)’的莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無(wú)顯著差異，但1號(hào)培養(yǎng)基上試管苗的株高顯著高于2號(hào)（表3和圖3）。

表2 MS培養(yǎng)基不同成分對(duì)‘隴薯7號(hào)’試管苗生長(zhǎng)的影響

表3 MS培養(yǎng)基不同成分對(duì)‘隴薯20號(hào)’試管苗生長(zhǎng)的影響

2.2 缺鐵對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，3號(hào)培養(yǎng)基缺鐵。接種13天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’在1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常，3號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗雖發(fā)出新芽，但葉片白化，植株生長(zhǎng)受阻（圖1 A）；‘隴薯20號(hào)’在2種培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常（圖2 A）。培養(yǎng)30天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’在1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長(zhǎng)正常，而3號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1 B）；‘隴薯20號(hào)’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常，且株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量在兩處理間無(wú)顯著差異（表3和圖3）。

圖1 ‘隴薯7號(hào)’試管苗

圖2 ‘隴薯20號(hào)’試管苗

2.3 缺鈣對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，4號(hào)培養(yǎng)基缺鈣。接種13天時(shí)，2個(gè)品種在1號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時(shí)，2個(gè)品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常。‘隴薯7號(hào)’植株的莖粗和葉片數(shù)在各處理間無(wú)顯著差異，而4號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗株高、莖葉鮮干重均顯著高于1號(hào)（表2），葉綠素含量顯著低于1號(hào)（圖3）；‘隴薯20號(hào)’植株的莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重在兩處理間無(wú)顯著差異，1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗株高顯著高于4號(hào)（表3），但4號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉綠素含量顯著高于1號(hào)（圖3）。

2.4 同時(shí)缺乏微量元素和鐵鹽對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，5號(hào)培養(yǎng)基同時(shí)缺乏微量和鐵鹽。接種13天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’在5號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗株高稍低于1號(hào)，但葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常；‘隴薯20號(hào)’在2種培養(yǎng)基上都葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常。培養(yǎng)30天時(shí)，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常，‘隴薯7號(hào)’除株高和葉綠素含量在兩處理間無(wú)顯著差異外（表2、圖3），5號(hào)培養(yǎng)基上試管苗的莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重均高于1號(hào)（表2）；‘隴薯20號(hào)’植株的株高在5號(hào)培養(yǎng)基上顯著低于1號(hào)，葉綠素含量顯著高于1號(hào)，莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重在兩處理間無(wú)顯著差異（表3、圖3）。

2.5 同時(shí)缺乏微量和鈣鹽對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，6號(hào)培養(yǎng)基同時(shí)缺乏微量和鈣鹽。接種13天時(shí)，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常，但6號(hào)培養(yǎng)基上的株高略低于1號(hào)（圖1A和圖2A）。培養(yǎng)30天時(shí)，兩品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常?！]薯7號(hào)’在6號(hào)培養(yǎng)基上的株高顯著低于對(duì)照，莖粗顯著高于1號(hào)，葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量與1號(hào)無(wú)顯著差異（表2和圖2）；‘隴薯20號(hào)’在6號(hào)培養(yǎng)基上的株高和葉綠素含量分別顯著低于和高于1號(hào)（表3和圖3），但莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重在兩處理間無(wú)顯著差異（表3）。

圖3 MS培養(yǎng)基不同成分對(duì)試管苗葉綠素含量的影響

2.6 同時(shí)缺乏鐵鹽和鈣鹽對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響

與1號(hào)相比，7號(hào)培養(yǎng)基同時(shí)缺乏鐵鹽和鈣鹽。接種13天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’在1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常，7號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，莖葉發(fā)黃，植株生長(zhǎng)緩慢；‘隴薯20號(hào)’在2種培養(yǎng)基上的試管苗都葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常（圖1A、圖2A）。培養(yǎng)30天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’在1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗仍葉色濃綠，生長(zhǎng)正常，而7號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉片白化，植株全部死亡（圖1B）；‘隴薯20號(hào)’在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常，7號(hào)培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于1號(hào)（表3和圖3）。

2.7 試管苗在只含MS大量元素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

與1號(hào)相比，8號(hào)培養(yǎng)基只含MS大量元素。接種13天時(shí)，2個(gè)品種在1號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗葉色濃綠、植株生長(zhǎng)正常，在8號(hào)培養(yǎng)基上的試管苗莖葉微黃；培養(yǎng)30天時(shí)，2個(gè)品種在2種培養(yǎng)基上的試管苗均葉色濃綠，植株生長(zhǎng)正常，‘隴薯7號(hào)’在8號(hào)培養(yǎng)基上試管苗的株高、莖葉干重和葉綠素含量高于1號(hào)培養(yǎng)基，但未達(dá)到顯著水平，而莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮重均顯著高于1號(hào)（表2、圖3）?！]薯20號(hào)’在8號(hào)培養(yǎng)基上的葉綠素含量顯著高于1號(hào)（圖3），株高、莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重與1號(hào)無(wú)顯著差異（表3）。

3 討論與結(jié)論

MS培養(yǎng)基是馬鈴薯組織培養(yǎng)中最為常用的基本培養(yǎng)基之一[17]，培養(yǎng)基的成分主要包括大量元素(KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4)、鈣鹽(CaCl·2H2O)、微量元素(MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CoCL2·6H2O、CuSO4·5H2O)、鐵鹽(Na2EDTA、FeSO4·7H2O)、有機(jī)（煙酸、VB6、VB6和甘氨酸）和肌醇。培養(yǎng)基成分直接影響試管苗的生長(zhǎng)[18]。鐵是葉綠素形成不可缺少的元素，在植株體內(nèi)很難轉(zhuǎn)移，鐵元素的缺乏會(huì)改變?nèi)~綠素的合成，使植物葉片黃化，表現(xiàn)為“失綠癥”[19]。本研究中，2個(gè)參試品種（‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’）對(duì)鐵元素缺乏的反應(yīng)不一樣。以除去有機(jī)的MS培養(yǎng)基為對(duì)照，接種在不添加鐵鹽培養(yǎng)基上的‘隴薯7號(hào)’試管苗莖葉白化，生長(zhǎng)完全被抑制，這與陳永波[20]關(guān)于缺鐵抑制鄂馬鈴薯3號(hào)脫毒試管苗生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致；而‘隴薯20號(hào)’在不添加鐵鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，植株生長(zhǎng)正常，且株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量與對(duì)照無(wú)顯著差異，這說(shuō)明馬鈴薯不同品種對(duì)鐵元素的需求量有很大的差異。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的一種大量元素[21]，適量濃度的鈣對(duì)植物的生長(zhǎng)是有益的，可增加植株鮮重、干物質(zhì)含量、根冠比和形成壯苗，植物缺鈣時(shí)，生長(zhǎng)旺盛組織的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，導(dǎo)致植株高度、葉片數(shù)量及生物產(chǎn)量下降[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種在不添加鈣鹽的培養(yǎng)基上時(shí)，2個(gè)品種都能正常生長(zhǎng)，‘隴薯7號(hào)’試管苗除葉綠素含量低于對(duì)照外，株高、葉片數(shù)、莖葉鮮干重均顯著高于對(duì)照，這與杜強(qiáng)[11]等關(guān)于缺鈣導(dǎo)致馬鈴薯栽培品種‘新大坪’試管苗的株高、葉片數(shù)、莖葉和根鮮干重均顯著低于常規(guī)MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)植株的結(jié)果不盡一致?！]薯20號(hào)’的株高顯著低于對(duì)照，這與杜強(qiáng)[11]等關(guān)于缺鈣不利于‘新大坪’試管苗生長(zhǎng)的研究結(jié)果基本一致。這表明鈣元素對(duì)馬鈴薯試管苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，缺鈣對(duì)生長(zhǎng)的影響因品種各異。有趣的是，‘隴薯20號(hào)’在同時(shí)缺乏鐵鹽和鈣鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，株高、莖粗、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對(duì)照，意味著鐵鹽和鈣鹽在‘隴薯20號(hào)’試管苗的生長(zhǎng)過(guò)程中有相互協(xié)同作用，這還有待進(jìn)一步研究。

微量元素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中需求較少，但對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育卻產(chǎn)生重要作用，特別是在植物的光合作用、呼吸作用、能量代謝等重要生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。陳永波[20]等采用不完全營(yíng)養(yǎng)液法研究微量元素的缺乏與過(guò)量對(duì)脫毒馬鈴薯苗生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)液中缺乏錳元素時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出葉片較小，舒展不開(kāi)，且出現(xiàn)卷曲，缺少Cu、Zn、Mo時(shí)無(wú)明顯癥狀表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，以除去有機(jī)的MS培養(yǎng)基為對(duì)照，全量省去微量元素對(duì)‘隴薯7號(hào)’沒(méi)有產(chǎn)生明顯的不利影響，試管苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量等各指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著差異，這與劉衛(wèi)平[12]以‘克新13號(hào)’和‘克新1號(hào)’為材料的研究結(jié)果一致。‘隴薯20號(hào)’在全量省去微量元素或同時(shí)省去鈣鹽和微量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，除株高顯著低于對(duì)照外，莖粗、葉片數(shù)和莖葉鮮干重與對(duì)照無(wú)顯著差異，這與陳永波[13]以‘鄂馬鈴薯3號(hào)’脫毒試管苗為研究對(duì)象時(shí)，缺乏微量元素導(dǎo)致植株葉片先出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)直至最后形成爛葉的研究結(jié)果不同，這種不同可能來(lái)源于品種的差異；在只含MS大量元素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’在前期均出現(xiàn)莖葉微黃的現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微黃現(xiàn)象逐漸消失，培養(yǎng)30天時(shí)，‘隴薯7號(hào)’的株高、莖粗、葉片數(shù)、莖葉鮮干重和葉綠素含量都高于對(duì)照，‘隴薯20號(hào)’的各指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著差異。為了保證試管苗質(zhì)量，通過(guò)比較所設(shè)8種培養(yǎng)基上試管苗的生長(zhǎng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’分別可以在MS大量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖和MS大量元素+微量元素+4.5 g/L瓊脂+30 g/L白糖的培養(yǎng)基上高效快繁。

本研究只對(duì)‘隴薯7號(hào)’和‘隴薯20號(hào)’的快繁培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，但馬鈴薯不同品種對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的需求存在較大差異，為了達(dá)到高效低成本的快繁目的，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)針對(duì)不同品種進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。與生產(chǎn)中普遍用常規(guī)MS全量培養(yǎng)基快繁試管苗相比，用只含大量元素的MS培養(yǎng)基快繁全國(guó)主導(dǎo)品種‘隴薯7號(hào)’脫毒試管苗，不僅操作簡(jiǎn)單、而且大幅度降低了成本，為滿足國(guó)家馬鈴薯脫毒種薯全覆蓋的需求奠定了基礎(chǔ)。