康志華，廖玉群，楊雷，熊家偉

江西藥都仁和制藥有限公司，江西 樟樹 331200

腎脾雙補口服液為獨家生產(chǎn)品種，處方由熟地黃、山藥、五味子（醋蒸）、枸杞子、菟絲子、山茱萸（制）、澤瀉、淫羊藿、陳皮、雞內(nèi)金（砂炒）、山楂（炒）、車前子共十二味組成。共奏補腎健脾之功效,用于脾腎兩虛之體倦食少，頭暈耳鳴，腰膝酸軟等癥。其注冊標(biāo)準(zhǔn)WS-5494-（B-0494）-2014Z 中已收載有山茱萸、淫羊藿苷、橙皮苷、熟地黃、枸杞子的薄層鑒別及淫羊藿苷的含量測定。生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷的含量測定方法煩瑣，重現(xiàn)性不是很理想，分析檢測周期較長。故經(jīng)過大量實驗摸索，對原方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的方法操作簡便，重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，具有專屬性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AD（日本島津公司）；安捷侖1260 Ⅱ（美國按捷侖公司）；色譜柱：安捷侖C18、月旭C18、依利特 C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm；賽多利斯公司電子天平：CP224S（d=0.1 mg），CP225D（d=0.01 mg、0.1 mg）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-201516）；腎脾雙補口服液樣品（江西藥都仁和制藥有限責(zé)任公司）；乙腈為色譜純（美國天地公司）；水為超純水；磷酸、乙醚、乙酸乙酯、乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原注冊標(biāo)準(zhǔn)方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（30∶70）為流動相；檢測波長為270 nm。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

對照品溶液的制備取淫羊藿苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL 含40 μg 的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密量取本品10 mL，加于已處理好的聚酰胺柱（柱內(nèi)徑約1 cm，聚酰胺粉50～80 目，5 g，干法上柱）上，放置2 h，用水50 mL 沖洗，棄去水洗液，再用乙醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，殘渣用50%甲醇使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

在大量的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，本法重現(xiàn)性不理想，影響因素較多，不能真實反映出淫羊藿苷的含量。

2.2 改進(jìn)后的方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）為流動相［1-7］；檢測波長為270 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

供試品溶液的制備：精密取本品10 mL，加水10 mL 稀釋，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液用乙酸乙酯振搖提取4 次［5-8］，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用稀乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液的制備：按處方取不含淫羊藿的其它藥材，依制法制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

測定法：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

分析方法確認(rèn)：按照《中國藥典》2015 年版四部通則9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，選取專屬性、檢測限、定量限、回收率、精密度、耐用性、穩(wěn)定性為確認(rèn)指標(biāo)，對改進(jìn)后的分析方法進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果淫羊藿苷能夠較好地分離，保留時間適中，陰性無干擾，專屬性好，色圖譜見圖1。

2.3 原注冊標(biāo)準(zhǔn)方法及改進(jìn)后的方法對比

取供試品（批號201001），分別采用原注冊標(biāo)準(zhǔn)方法及改進(jìn)后的方法，進(jìn)行精密度、加樣回收率、耐用性試驗，測定淫羊藿苷的含量，檢測結(jié)果見表1，2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果對比（%）

結(jié)果，原注冊標(biāo)準(zhǔn)方法精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為8.5%、6.3%和7.3%，改進(jìn)后方法的精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為0.57%、0.31%和0.69%，表明原方法的精密度、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性不理想，RSD 均超過2%，而改進(jìn)后方法的精密度、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性良好，能真實地反應(yīng)出本品中淫羊藿苷的含量，可用于本品的質(zhì)量控制［9-17］。

3 樣品測定

取本品10 批，分別按原方法及改進(jìn)后的方法測定淫羊藿苷的含量，改進(jìn)后的方法檢測的淫羊藿苷的含量均比原方法檢測結(jié)果高。結(jié)果見表3。

表3 10批樣品中淫羊藿苷的含量

4 討論

4.1 供試品溶液的制備

原標(biāo)準(zhǔn)將樣品通過聚酰胺柱進(jìn)行柱層析，去除部分雜質(zhì)的同時對淫羊藿苷也會有一定的吸附，且層析柱的裝填緊實度、洗脫的速度等，對結(jié)果均有影響，造成方法重現(xiàn)性不理想，回收率偏低［7］；故對方法進(jìn)行改進(jìn)研究，試驗中曾采用大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析［8］,結(jié)果回收率偏低;以先采用乙醚振搖提取，除去脂溶性成分，再用乙酸乙酯振搖提取4 次的方法為佳，淫羊藿苷提取完全，方法簡便，重現(xiàn)性好，回收率理想。故按改進(jìn)后的方法檢測的淫羊藿苷的含量均比原方法檢測結(jié)果高。

4.2 流動相的選擇

原標(biāo)準(zhǔn)中采用乙腈-水（30∶70）為流動相，結(jié)果淫羊藿苷峰拖尾嚴(yán)重；分別對比了冰醋酸溶液與磷酸溶液的對峰形的改善效果，結(jié)果采用乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）為流動相，有效地改善了峰形，淫羊藿苷能達(dá)到理想分離。

4.3 實驗過程

考察了不同提取溶劑（正丁醇、氯仿、乙酸乙酯）、提取次數(shù)（3 次、4 次、5 次）對結(jié)果的影響，結(jié)果以乙酸乙酯提取4 次為佳。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，具有專屬性，更能真實地反映本品中淫羊藿苷的含量，可用于腎脾雙補口服液的質(zhì)量控制。