張日欣 ， 范 強 ， 賀永明 ， 俞美子

(遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 ， 遼寧 營口 115009)

沙門菌是一種常見的人獸共患病原菌，不僅造成養(yǎng)殖戶嚴重的經(jīng)濟損失，同時威脅著人類的食品安全，每年都有大量人群被感染，敗血癥或胃腸炎等是感染沙門菌的典型癥狀[1-3]。莊河大骨雞是遼寧省培育的地方特色雞群，其以體大敦實，覓食能力強，產(chǎn)蛋多且大，肉質(zhì)鮮嫩等特點[4-5]。近幾年，莊河大骨雞飼養(yǎng)在遼南地區(qū)發(fā)展迅猛，規(guī)模化養(yǎng)殖場與日俱增，在感染莊河大骨雞的眾多病原菌中，沙門菌是較常見的致病菌，嚴重制約了莊河大骨雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]。因此，對莊河大骨雞中沙門菌的病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料收集 于蓋縣、莊河、岫巖、遼陽等地區(qū)莊河大骨雞養(yǎng)殖場中隨機抽樣選取雞390只，取雞的心臟、肝臟、腸道等組織器官作為被檢材料，標號。

1.2 質(zhì)控菌株 本次試驗使用質(zhì)控菌株為ATCC 14028，購自北京蘭博瑞生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與試劑 生物安全柜(NUAIRE公司)；全自動高壓立式滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱(上海申安醫(yī)療器械有限公司)；PCR擴增儀(美國伯樂BIO-RAD公司)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；各種細菌微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒、2×PCR SuperMix、Marker 2 000 bp，均購自天根生物科技(北京)有限公司。

1.4 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采集雞的心臟、肝臟、腸道等組織器官，劃線接種于無菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板及SS瓊脂培養(yǎng)基平板上，(36±1)℃培養(yǎng)24 h。 觀察生長結(jié)果，選單個菌落繼續(xù)純化培養(yǎng)，保種用于后續(xù)鑒定。

1.5 顯微鏡觀察 選取純化培養(yǎng)后的單個菌落涂片進行革蘭染色，鏡檢觀察細菌形態(tài)。

1.6 生化試驗 根據(jù)所購買的細菌生化鑒定管的說明書要求，對初步分離出來的沙門菌分離株依次接種于吲哚、丙二酸鹽、鄰硝基酚β-D-半乳糖昔(ONPG)、尿素、蔗糖、麥芽糖、尿素、甘露醇、乳糖等生化管中，經(jīng)(36±1) ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.7 藥敏試驗 選取單個的疑似菌落進行純培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液均勻的涂抹于普通固體培養(yǎng)基上，用無菌鑷子輕輕夾取各種藥敏紙片輕輕貼于培養(yǎng)基表面。各個藥敏紙片的中心距離應(yīng)大于2.5 cm，每個藥敏紙片距離平皿邊緣的距離應(yīng)該大于1.5 cm。 貼完后，將平皿倒置于恒溫箱中，(36±1)℃培養(yǎng)24 h后觀察，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)藥敏標準進行判定。

1.8 血清型鑒定 參照GB 4789.4—2016《沙門氏菌檢驗》采用A～F多價O血清及單因子血清鑒定沙門菌的O抗原，根據(jù)O抗原及H抗原第1相和第2相反應(yīng)結(jié)果進行血清分群和定型。

1.9 耐藥基因檢測 根據(jù)GenBank上發(fā)表的基因序列，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻，結(jié)合軟件Primer 5.0引物設(shè)計，設(shè)計3對引物用來擴增四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類代表性耐藥基因。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：Premix TaqTM10.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，滅菌雙蒸水7.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，51～55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequence of PCR amplification

2 結(jié)果

2.1 沙門菌的分離 培養(yǎng)24 h后，部分菌株在SS培養(yǎng)基可見黑色透明菌落，繼續(xù)分離培養(yǎng)。麥康凱培養(yǎng)基可見無色菌落。經(jīng)純化、染色、鏡檢,確定為革蘭陰性菌，鏡檢可見菌體短小、兩端鈍圓，多分散存在。初步判定分離株為沙門菌，共計51株。

2.2 沙門菌的生化鑒定 生化鑒定結(jié)果見表2。51株分離株中49株分離株對葡萄糖、賴氨酸脫氫酶、果糖、甘露醇結(jié)果呈陽性，對乳糖、鳥氨酸、蔗糖、尿素、吲哚試驗呈陰性，與中國微生物菌種目錄給出的沙門菌生化反應(yīng)結(jié)果一致。本次試驗中共檢測樣品390份，分離鑒定后得到49株沙門菌，分離率為12.56%。

表2 生化反應(yīng)Table 2 Biochemical reaction

2.3 沙門菌藥敏試驗 結(jié)果顯示，49株沙門菌株對12種抗生素的耐藥率最高的集中在氟苯尼考，耐藥率為87.76%。對四環(huán)素(77.55%)、青霉素(73.47%)、慶大霉素(71.43%)耐藥率也較高。本試驗分離鑒定后得出49株沙門菌對抗生素耐藥情況見表3。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test

對沙門菌進行多重耐藥性分析，49株沙門菌均對12種抗菌藥物有多重耐藥性，結(jié)果見表4。其中表現(xiàn)2種或2種以上藥物有多重耐藥性，4耐菌株所占比例最大，占28.57%，多重耐藥現(xiàn)象較為嚴重。分離株至少對2種藥物耐藥，并且表現(xiàn)為多重耐藥性，表明在沙門菌病治療時最好根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，有針對性地科學(xué)用藥，實際生產(chǎn)中可選用氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素、慶大霉素等敏感藥物。

表4 49株沙門菌的耐受抗生素種類分布Table 4 Distribution of resistant antibiotic species in 49 Salmonella strains

2.4 沙門菌分離株的血清學(xué)鑒定 49株沙門菌分離株經(jīng)血清學(xué)鑒定后，共鑒定出4種血清型，其中雞白痢沙門菌(1,9,12，-)為26株，占總沙門菌株的53.06%；其次，鼠傷寒沙門菌(1,4,5,12，i：1,2,)17株， 占總沙門菌株的34.69%；甲型副傷寒沙門菌(1,2,12，a：-)4株，占總沙門菌株的8.16%；曼哈頓沙門菌(6,8，d：1,5)2株，占總沙門菌株的4.08%。

2.5 耐藥基因的檢測 對49株沙門菌分離株的DNA進行PCR擴增，結(jié)果顯示，blaTEM耐藥基因檢出率最高，42株(占85.71%)；其次為aadA1，32株(占65.31%)；tetB，27株(占55.10%)。3種耐藥基因全部檢出的分離株為22株(占44.90%)。見圖1～3。

圖1 耐藥基因tetB PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of drug resistance gene tetBM：DL-2 000分子標記物； 1:陰性對照； 2、3、5、6:疑似沙門菌陽性樣品； 4:疑似沙門菌陰性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2,3,5,6:Suspected Salmonella positive samples; 4:Suspected Salmonella negative samples

圖2 耐藥基因blaTEM PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of drug resistance gene blaTEMM：DL-2 000分子標記物； 1:陰性對照； 2:疑似沙門菌陰性樣品； 3～6:疑似沙門菌陽性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples

圖3 耐藥基因aadA1 PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of drug resistance gene aadA1M：DL-2 000分子標記物； 1:陰性對照； 2:疑似沙門菌陰性樣品； 3～6:疑似沙門菌陽性樣品M:DL-2 000 molecular marker; 1:Negative control; 2:Suspected Salmonella negative samples; 3-6:Suspected Salmonella positive samples

3 討論

沙門菌感染是一種常見的人獸共患疾病，可造成嚴重的經(jīng)濟損失，深深困擾著莊河大骨雞的養(yǎng)殖戶們，面對沙門菌感染的嚴峻形勢，許多養(yǎng)殖戶選擇在養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素，這使得沙門菌的耐藥譜型迅速增寬[8-9]。有報道稱，2018年華東地區(qū)共計分離出沙門菌71株，其中多重耐藥率高達93.94%[10]。遼寧地區(qū)養(yǎng)殖場沙門菌分離率為20.73%，其中41.98%的分離株為3類及3類以上耐藥菌株[11]。由此可見，禽源沙門菌耐藥性的問題日趨嚴峻。

本試驗對遼南地區(qū)莊河大骨雞養(yǎng)殖戶進行篩查，沙門菌分離率為12.56%，雞沙門菌分離株為49株，鑒定出4種血清型，依次為：雞白痢沙門菌，占53.06%；鼠傷寒沙門菌，占34.69%；甲型副傷寒沙門菌，占8.16%；曼哈頓沙門菌，占4.08%。耐藥性最高的3種抗生素依次為氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素，耐藥率依次為87.76%、77.55%、73.47%。49株沙門菌對12種抗生素均有不同程度的耐藥性，且均為多重耐藥菌株。其中最少的耐藥2種，最多耐藥7種。表現(xiàn)2種或2種以上藥物有多重耐藥性，4耐菌株所占比例最大，占全部分離株的28.57%。耐藥結(jié)果一定程度上表明遼南地區(qū)莊河大骨雞沙門菌耐藥的嚴峻性。造成這方面原因可能是：養(yǎng)殖戶過度依賴抗生素，也可能是不同地區(qū)不同血清型的沙門菌對藥物的耐受程度有差異，或者抗生素的應(yīng)用劑量和方法的不科學(xué)[12-14]。在實際生產(chǎn)中對沙門菌病治療時最好根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，有針對性地科學(xué)用藥，實際生產(chǎn)中可選用氟苯尼考、四環(huán)素、青霉素、慶大霉素等敏感藥物。對耐藥性較高的3種類型抗生素進行耐藥基因的檢測，blaTEM、aadA1、tetB三種耐藥基因的檢出率分別為85.71%、65.31%、55.10%。3種耐藥基因全部檢出的分離株為22株(占44.90%)。可見耐藥基因的檢出率與耐藥情況關(guān)系密切，耐藥基因的攜帶與耐藥嚴重程度呈正相關(guān)，同時考慮到食用雞肉抗生素的殘留禁用情況，此次篩選沒有選用氧氟沙星和恩諾沙星[15]。因此在莊河大骨雞的養(yǎng)殖過程中，首先要做好種源沙門菌的凈化，從源頭上切斷沙門菌的感染，同時應(yīng)及時有效的對發(fā)病雞群進行藥敏試驗，嚴格遵循藥物使用流程，以達到科學(xué)飼養(yǎng)的目的。