高一丁 ， 張偉偉 ， 鄧曉昆 ， 王 權(quán) ， 于詠蘭

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心 ， 北京 海淀 100089)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)，又名綠膿桿菌，感染犬、貓時(shí)最常見(jiàn)的是引起耳道炎及表皮或深部的膿皮癥，也偶見(jiàn)尿路、呼吸道和血液感染等[1]。臨床治療P.aeruginosa感染難度較大，因其對(duì)多種臨床常用抗生素，如氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松有天然耐藥性[2]。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的機(jī)制主要為2種：作用靶點(diǎn)的突變與質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥(Plasmid meditated quinolone resistance,PMQR)。作用靶點(diǎn)的突變被認(rèn)為是細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮耐藥的主要機(jī)制，而質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥目前被認(rèn)為常出現(xiàn)在腸桿菌科細(xì)菌中。氟喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的2種Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，分別由gyrA、gyrB基因和parC、parE基因調(diào)控。當(dāng)這些基因發(fā)生突變，導(dǎo)致氨基酸序列改變時(shí)，藥物與作用靶點(diǎn)結(jié)合的緊密性被破壞導(dǎo)致藥物失效[3]。來(lái)源于質(zhì)?？山閷?dǎo)氟喹諾酮耐藥的基因包括qnr基因家族，aac(6’)-Ib-cr基因、oqxAB基因和qepA基因，其介導(dǎo)氟喹諾酮耐藥的機(jī)制包括保護(hù)藥物作用位點(diǎn)、水解藥物和主動(dòng)將藥物排出細(xì)菌體等[4]。

關(guān)于P.aeruginosa耐藥性的研究，目前國(guó)內(nèi)大多集中于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，少有關(guān)于犬、貓?jiān)碢.aeruginosa的相關(guān)研究。氟喹諾酮類藥物抗藥譜廣、吸收好、副作用低，被作為治療細(xì)菌感染的常用藥，并存在濫用現(xiàn)象。本試驗(yàn)收集52株來(lái)源于犬、貓的P.aeruginosa，通過(guò)瓊脂稀釋試驗(yàn)檢測(cè)其耐藥譜，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增探索其對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥基因，為犬、貓P.aeruginosa感染后的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)檢測(cè)P.aeruginosa共52株，采集于2017年12月—2019年1月，其中20株為北京聯(lián)寵國(guó)際檢測(cè)中心分離保存，32株為本實(shí)驗(yàn)室保存樣品。其中皮膚源菌株17株，耳道源菌株18株，呼吸道菌株17株。52株菌株中，33株來(lái)源于犬，19株來(lái)源于貓。

1.2 試劑和儀器 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司、上海陶素生化科技有限公司和中國(guó)食品藥品檢定研究院；MH(A)瓊脂干粉，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR Mix、PCR Marker、核酸染料及TAE緩沖液等試劑，均購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司。試驗(yàn)中使用的引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。主要試驗(yàn)儀器包括：海爾青島股份有限公司HR40-IIA2生物安全柜，MCO-18AC三洋二氧化碳培養(yǎng)箱，北京六一生物科技有限公司DYY-6D 型電泳儀和Vetri 96 梯度基因擴(kuò)增儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株藥敏試驗(yàn) 將保存好的菌株接種于血瓊脂平板上，在37 ℃條件下過(guò)夜復(fù)蘇獲得純化菌落。參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)-VET08標(biāo)準(zhǔn)所記錄的瓊脂稀釋法測(cè)定菌株對(duì)左氧氟沙星、馬波沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。試驗(yàn)中各藥物所需溶劑與助溶劑參考CLSI-VET08與2018版CLSI標(biāo)準(zhǔn)所述。

1.3.2 菌株氟喹諾酮耐藥機(jī)制分析 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取所有菌株的基因組DNA作為Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因模板，并擴(kuò)增目標(biāo)序列。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR擴(kuò)增體系：模板4 μL，TaqMix 25 μL，ddH2O 17 μL，上下游引物各2 μL。各目標(biāo)序列所用引物參照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取所有菌株的質(zhì)粒DNA作為PMQR基因模板，并擴(kuò)增目標(biāo)序列。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。PCR體系:模板4 μL、TaqMix 25 μL、ddH2O 17 μL、上下游引物各2 μL。各目標(biāo)序列所用引物參考文獻(xiàn)[5]，見(jiàn)表1。配制2%瓊脂糖凝膠，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，并將陽(yáng)性產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序，將所得序列與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)鑒定。

表1 各目標(biāo)序列擴(kuò)增引物Table 1 Amplifyication primers of each target sequences

2 結(jié)果

2.1 菌株藥敏試驗(yàn) 藥物瓊脂平板上的P.aeruginosa以單菌落的形式生長(zhǎng)，在低濃度藥物瓊脂平板上可見(jiàn)黃綠色或綠色色素?cái)U(kuò)散，質(zhì)控菌對(duì)所有藥物的MIC均在規(guī)定范圍內(nèi)，試驗(yàn)菌株對(duì)各抗生素的敏感率見(jiàn)表2。

表2 犬、貓銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of Pseudomonas aeruginosa in dogs and cats

2.2 菌株氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制分析 52株P(guān).aeruginosa中，均未檢測(cè)出qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因和oqxAB基因，共有19株菌株檢測(cè)出aac(6’)-Ib基因，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)后，19條序列均為單一功能的氨基糖苷酰基轉(zhuǎn)移酶，無(wú)介導(dǎo)氟喹諾酮耐藥功能。經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增后，52株菌株均擴(kuò)增出了gyrA、gyrB、parC、parE基因序列，見(jiàn)表2。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，共9株菌株發(fā)生了GyrA氨基酸的替代；3株發(fā)生了ParC氨基酸的替代；5株發(fā)生了ParE氨基酸的替代；無(wú)菌株發(fā)生GyrB氨基酸的替代，見(jiàn)表3。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用偏相關(guān)分析對(duì)GyrA、ParC、ParE氨基酸替換與氟喹諾酮類藥物耐藥結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中，GyrA氨基酸替換(r=0.392，P=0.004)、ParC氨基酸替換(r=0.326，P=0.018)、ParE氨基酸替換(r=0.294，P=0.034)均與氟喹諾酮類藥物耐藥性呈低度相關(guān)。GyrA、GyrB、ParC、ParE 氨基酸替代與恩諾沙星、馬波沙星、左氧氟沙星的 MIC的關(guān)系見(jiàn)表4。

表3 Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶的氨基酸替代結(jié)果Table 3 The amino acids alternation in type Ⅱ topoisomerase

表4 氨基酸替換與氟喹諾酮類藥物最小抑菌濃度之間的關(guān)系Table 4 The relationship between amino acid alternation and fluoroquinolones MIC

3 討論

本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所有菌株對(duì)頭孢他啶與頭孢吡肟最敏感，2種藥物均只有1株菌株對(duì)其耐藥，這與文獻(xiàn)報(bào)道的世界范圍內(nèi)P.aeruginosa感染治療中，頭孢他啶與頭孢吡肟均為對(duì)抗P.aeruginosa感染的首選用藥[6]是吻合的。頭孢吡肟是第4代頭孢菌素類的代表藥物，頭孢他啶是第3代半合成藥物，對(duì)多重耐藥革蘭陰性桿菌具有良好的療效，建議選用頭孢他啶與頭孢吡肟作為P.aeruginosa感染時(shí)的首選用藥。本試驗(yàn)中各菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥率較高，分別為恩諾沙星19.2%、馬波沙星30.8%和左氧氟沙星15.4%，這一結(jié)果與Rubin等[7]在2008年發(fā)現(xiàn)的該菌對(duì)恩諾沙星耐藥率31%、馬波沙星27%、左氧氟沙星16%接近。

氟喹諾酮類藥物具有抗菌譜廣、副作用小、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，其代表藥物恩諾沙星(商品名拜有利)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于犬、貓臨床。在獲得藥敏檢查結(jié)果之前，為了避免可能存在的多重耐藥導(dǎo)致前期治療失敗，推薦選用氟喹諾酮類藥物與β內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合用藥作為治療方案。

碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線，細(xì)菌對(duì)其耐藥性的變化是耐藥監(jiān)測(cè)工作的重點(diǎn)。本次試驗(yàn)中，亞胺培南的耐藥率為46.2%，2017年楊桐等[8]對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)動(dòng)物醫(yī)院分離的細(xì)菌的耐藥研究顯示，P.aeruginosa對(duì)亞胺培南的耐藥率為23.6%，遠(yuǎn)低于本次試驗(yàn)的結(jié)果。這可能與部分獸醫(yī)盲目選擇其作為首選藥物有關(guān)?？紤]到公共健康安全，建議加以密切關(guān)注。

Lin等[9]在2012年進(jìn)行的試驗(yàn)中，P.aeruginosa對(duì)阿米卡星的耐藥率為11.1%，慶大霉素的耐藥率為14.8%，亞胺培南的耐藥率為0，與本試驗(yàn)結(jié)果差距較大。但其阿米卡星和慶大霉素的MIC50分別為<4 μg/mL和4 μg/mL，MIC90分別為8 μg/mL和>128 μg/mL，慶大霉素的MIC90遠(yuǎn)高于折點(diǎn)值，說(shuō)明慶大霉素可能不適用于P.aeruginosa的治療。Lin等[9]試驗(yàn)中亞胺培南的MIC90為4 μg/mL，本試驗(yàn)中亞胺培南的MIC90為8 μg/mL，位于藥物敏感范圍內(nèi)，可用于臨床治療。2008年Rubin等[7]的試驗(yàn)中阿米卡星和慶大霉素的耐藥率為3%和7%，MIC50與MIC90均小于折點(diǎn)值，這種差異可能是由于樣本來(lái)源的區(qū)域和時(shí)間不同，以及個(gè)體宿主差異所造成。

目前各種針對(duì)動(dòng)物源的藥敏試驗(yàn)中使用的耐藥折點(diǎn)版本混亂，主要有CLSI獸醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)、CLSI人類臨床標(biāo)準(zhǔn)和EUCAST歐洲臨床標(biāo)準(zhǔn)3種，受藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)影響，各參考標(biāo)準(zhǔn)中不同菌株對(duì)不同物種的耐藥折點(diǎn)均有差異，人類臨床醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)臨床所使用的參考標(biāo)準(zhǔn)中的折點(diǎn)也有所不同，折點(diǎn)的改變可能導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)很大差異，所以對(duì)于獸醫(yī)中未給出明確折點(diǎn)的藥物，評(píng)估其抗菌能力應(yīng)以臨床治療效果為主。

本次試驗(yàn)中未檢測(cè)到任何PMQR基因，這也與目前已發(fā)表的一些結(jié)果相一致。目前研究認(rèn)為，PMQR基因主要的攜帶者是腸桿菌科。然而隨著時(shí)間發(fā)展，目前有少量研究報(bào)道了在假單胞菌屬細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)PMQR基因。2015年胡凡[10]從51株豬源和雞源P.aeruginosa中分離到了7例aac(6’)-Ib-cr基因、5例qnrS基因以及3例qnrB基因。2018年Vingopoulou等[11]從78株犬中耳炎病例中采集到的P.aeruginosa中分離到了2例qnrA，2例qnrS和1例qnrB基因。

P.aeruginosa主要的GyrA與ParC替換位點(diǎn)與腸桿菌科相似，1999年Akasaka等[3]檢測(cè)了150株耐左氧氟沙星P.aeruginosa的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶突變情況，其中119株出現(xiàn)了GyrA的氨基酸替換，主要替換模式是第83位的Thr替換為Ile或Ala，第87位的Asp替換為Asn、Gly、Tyr；第27株出現(xiàn)GyrB的氨基酸替換，主要替換模式是第470位的Glu替換為Asp；第84株出現(xiàn)ParC的氨基酸替換，主要替換模式為第87位的Ser替換為L(zhǎng)eu或Trp；13株出現(xiàn)ParE的氨基酸替換，其中包括第473位的Ala替換為Val和第459位的Glu替換為Val。本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的各種氨基酸替換與該試驗(yàn)結(jié)果[3]部分一致。Vingopoulou等[11]和Thirumalmuthu等[12]分別從中耳炎和角膜炎樣本中分離到的P.aeruginosa都發(fā)現(xiàn)了以GyrA中第83位由Thr替換為Ile，和ParC中第87位由Ser替換為L(zhǎng)eu為主的氨基酸突變模式，Thirumalmuthu等[12]還發(fā)現(xiàn)了1例ParC中第752位氨基酸由Pro替換為Thr。

Akasaka等[3]證明，GyrB和ParE單獨(dú)發(fā)生替換時(shí)，不會(huì)對(duì)菌株耐藥性產(chǎn)生顯著增強(qiáng)，而GyrA單獨(dú)替換會(huì)顯著增高菌株耐藥性，當(dāng)GyrA發(fā)生2處替換時(shí)菌株耐藥性會(huì)更強(qiáng)，而當(dāng)ParC與GyrA同時(shí)發(fā)生替換時(shí)，會(huì)使這個(gè)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。在本試驗(yàn)中(表4)，有3株菌株出現(xiàn)了GyrA替換表現(xiàn)了氟喹諾酮類的耐藥，但仍有2株菌株出現(xiàn)了GryA的替換仍對(duì)藥物敏感。受限于樣本數(shù)量，本試驗(yàn)各菌株中GyrA均只出現(xiàn)1處替換，2株菌株同時(shí)出現(xiàn)了GyrA和ParC的替換但對(duì)藥物的耐藥性并無(wú)進(jìn)一步提升；本次試驗(yàn)中1株菌株單獨(dú)發(fā)生了ParC的替換后對(duì)3種氟喹諾酮類藥物的耐藥性出現(xiàn)超常地提高，超過(guò)了ParC和GyrA雙替換的2株菌株；有2株菌株單獨(dú)發(fā)生了ParE的突變，對(duì)氟喹諾酮的MIC都超過(guò)了耐藥折點(diǎn)?？傊?，由于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變致氨基酸替換進(jìn)而導(dǎo)致P.aeruginosa耐藥性改變是相當(dāng)復(fù)雜的事件，需要積累更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)才能找到其規(guī)律。另外，本次試驗(yàn)中有9株未發(fā)生任何氨基酸突變的菌株也對(duì)所有氟喹諾酮類藥物耐藥，這說(shuō)明試驗(yàn)菌株可能存在其他耐藥機(jī)制的作用，如生物膜、主動(dòng)外排系統(tǒng)、孔蛋白缺失等，需要進(jìn)一步地研究來(lái)證實(shí)。

P.aeruginosa感染是犬、貓臨床常見(jiàn)的傳染性疾病，本研究犬、貓P.aeruginosa對(duì)抗生素藥物耐藥性的檢測(cè)和氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的分析為臨床犬、貓P.aeruginosa感染的防治提供了參考。