沈亞楠 谷 江 張永春 羅浩鳴

靶向藥物在靶向抑制腎癌細(xì)胞時(shí)，腎癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的抵抗作用，導(dǎo)致藥物的抑制效果逐漸減弱，但具體的抵抗機(jī)制尚未明確[1]。研究發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞中有STC-1蛋白的存在[2]。STC-1即斯鈣素蛋白1，是最早在魚類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白激素，主要調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝[3]。STC-1以濃度依賴的方式刺激線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。有研究指出，STC-1調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的過程可能參與腎癌細(xì)胞對靶向藥物的抵抗[5]。

所謂鈣穩(wěn)態(tài)是指細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液的離子鈣水平穩(wěn)定[6]。鈣穩(wěn)態(tài)是影響腫瘤細(xì)胞增殖和存活的重要因素[7]。索拉菲尼能夠抑制腫瘤血管生成，引起腫瘤細(xì)胞缺氧，容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，造成細(xì)胞損傷，而STC-1可能是一種抗凋亡和致癌因子，所以創(chuàng)新性地將STC-1調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)引入到腎癌細(xì)胞抵抗靶向藥物的研究中，觀察這種抵抗作用是否與STC-1調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)，或能為逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞的耐藥性提供新的思路[4，8]。

材料與方法

1.主要材料與儀器：1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、PBS(磷酸緩沖鹽溶液)購自美國Hyclone公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA購自美國Gibco公司；MTT試劑盒購自凱基生物體；DMSO(二甲基亞砜)購自美國AMRESCO公司；索拉菲尼購自德國拜耳公司；總RNA提取試劑盒購自美國Fermentas 公司；ELLSA試劑盒購自美國R&D公司；9孔板、15ml及50ml離心管購自康寧公司；酶標(biāo)儀(elx808)購自美國Thermo公司；低速離心機(jī)(SC-3612型)購自中佳公司；Fura-2 AM鈣離子探針購自碧云天生物技術(shù)研究所；人腎癌GRC-1細(xì)胞購自上海弗雷堡生物公司。

2.培養(yǎng)液的配制：在50ml的離心管中加入500μl的青霉素、鏈霉素混合物、5ml的胎牛血清以及1640培養(yǎng)基，制備含有1%青霉素鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人腎癌GRC-1細(xì)胞，置于37℃和5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞附壁后，每2天傳代1次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4.MTT法檢測索拉菲尼對腎癌細(xì)胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h并加入藥物。實(shí)驗(yàn)分為：索拉非尼(1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L)用藥組和不加藥的對照組。為每個(gè)劑量設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，添加藥物后培養(yǎng)24h，然后向每個(gè)孔中添加20μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后終止培養(yǎng)，棄上清液，向每孔加入DMSO 150μl，低速振蕩10min以完全溶解晶體。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm處測量每個(gè)孔吸光度(A)值，并計(jì)算每組藥物對細(xì)胞增殖的抑制率，抑制率(%)=(1- 實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

5.反轉(zhuǎn)錄PCR測定STC-1基因表達(dá)：采用RT-PCR法測定各組細(xì)胞的STC-1基因表達(dá)水平，用試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，取1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并合成cDNA。引物序列β-actin,正向5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′，反向5′-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3′，片段長度531bp；STC-1，正向5′-TGAGGTCGTCCAGCTCCCAATC-3′，反向5′-GGCACAGTGGTCTGTCTGCAGGATG-3′，片段長度142bp。RT-PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3min，變性94℃ 30s，退火53℃ 30s，延伸72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)后，終止反應(yīng)72℃ 5min；以β-actin作為內(nèi)部參照，PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，并用凝膠成像儀照相。

6.采用ELLSA法測定各組細(xì)胞STC-1蛋白表達(dá)：使用PMSF和細(xì)胞裂解液裂解每組細(xì)胞，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液，并以50微升/孔滴加到酶標(biāo)板中，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔分別進(jìn)行測試。按試劑盒說明書(美國R&D公司)操作，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，根據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算STC-1蛋白表達(dá)水平。

7.熒光分光光度法測各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量：不同濃度索拉非尼干擾腎癌細(xì)胞24h并消化成細(xì)胞懸液，以1000r/min離心5min，棄上清液，將細(xì)胞重懸于含0.2%小牛血清白蛋白的D-Hanks溶液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為8×105/ml。加入Fura-2/AM，37℃避光孵育45min。用D-Hanks溶液洗滌細(xì)胞2次，再將細(xì)胞重懸于3ml D-Hanks溶液中，雙波長熒光分光光度計(jì)測量細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

8.化學(xué)比色法測定Ca2+-ATP酶活性：ATPase可以分解ATP產(chǎn)生ADP和無機(jī)磷，通過測試無機(jī)磷的含量來確定ATPase的活性水平，以1mg/h的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol的Pi量為1個(gè)ATP酶活力單位，即1μmol/(mg·h)。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

結(jié) 果

1.索拉菲尼對腎癌細(xì)胞增殖的影響：MTT法的結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，但以藥物濃度10μmol/L為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，抑制率趨于穩(wěn)定，但均高于中低濃度組，中低濃度組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。腎癌細(xì)胞抑制率呈逐漸上升趨勢，但以10μmol/L為濃度轉(zhuǎn)折點(diǎn)，細(xì)胞抑制率逐漸趨向平穩(wěn)。

表1 不同濃度索拉菲尼對腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用

2.RT-PCR檢測腎癌細(xì)胞內(nèi)STC-1mRNA表達(dá)水平：各組細(xì)胞中STC-1mRNA的表達(dá)逐漸增加，從10μmol/L藥物濃度開始增加更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1，表2)。

表2 各組細(xì)胞內(nèi)STC-1mRNA與STC-1蛋白表達(dá)水平

圖1 索拉菲尼干預(yù)腎癌細(xì)胞后STC-1的基因表達(dá)

3.ELISA法檢測STC-1蛋白表達(dá)量：各組細(xì)胞內(nèi)STC-1表達(dá)量逐漸增高，并在10μmol/L藥物濃度時(shí)增量較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

4.熒光分光光度法測各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量：各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+逐漸增加，從10μmol/L的藥物濃度開始趨于穩(wěn)定，中低濃度組兩兩比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

5.化學(xué)比色法測定各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATPase 活性：各組細(xì)胞內(nèi)鈣酶活性逐漸下降，從10μmol/L藥物濃度開始趨于穩(wěn)定，中低濃度組兩兩比較后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與Ca2+-ATPase 活性

結(jié) 果

目前，靶向治療可顯著延長晚期腎癌患者的無進(jìn)展生存期和總體生存期，并顯著改善患者的預(yù)后[9]。索拉菲尼因其自身在抗腫瘤活性及藥物耐受性上表現(xiàn)優(yōu)異，是晚期腎癌靶向治療的一線用藥，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼的長期使用會(huì)伴隨耐藥性的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響治療效果[10，11]。結(jié)合索拉菲尼在抑制腎癌細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)STC-1異常變化及鈣穩(wěn)態(tài)改變的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以STC-1作為切入點(diǎn)，研究索拉菲尼抑制腎癌細(xì)胞時(shí)STC-1與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)變化之間的關(guān)系，并探討對腎癌細(xì)胞增殖的影響。

索拉菲尼抑制腎癌細(xì)胞時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，鈣離子受到STC-1的調(diào)控[12]。STC-1在促進(jìn)腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，但尚未明確[13]。STC-1調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)機(jī)制是否參與了索拉菲尼對腎癌細(xì)胞的抵抗作用亦不清楚，因此通過本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，筆者研究發(fā)現(xiàn)隨著索拉菲尼濃度的依次遞增，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量、鈣酶活性及STC-1圍繞濃度轉(zhuǎn)折點(diǎn)發(fā)生規(guī)律性變化。這表明，STC-1可能通過調(diào)控Ca2+水平，避免鈣超載引起的細(xì)胞凋亡。

作為儲(chǔ)存Ca2+的主要場所，線粒體支持的生物學(xué)功能通常由Ca2 +控制，Ca2+水平紊亂可能會(huì)加劇線粒體功能障礙和能量衰竭，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡[14]。作為細(xì)胞中重要的第二信使，Ca2+參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分泌，并能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[15，16]。Ca2+通過啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞中信號，對控制血管張力和內(nèi)皮通透性有重要作用[17]。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過質(zhì)膜Ca2+-ATPase和Na+/Ca2+交換將細(xì)胞質(zhì)中過量的Ca2+移至細(xì)胞外，從而維持細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)[18]。Ca2+-ATPase(PMCA)活性的降低導(dǎo)致鈣離子在細(xì)胞質(zhì)中積累，而腎細(xì)胞中PMCA是主要的鈣輸出蛋白，因此可以測定腎癌細(xì)胞PMCA活性反映鈣穩(wěn)態(tài)情況[19]。

鈣離子水平增高可能會(huì)引起STC-1的變化。STC-1被證明在腎臟中高表達(dá)，并關(guān)鍵性地調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化，以及調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[20]。STC-1可以下調(diào)鈣離子水平，維持鈣離子穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞生長[21]。因此，隨著索拉非尼濃度的遞增，可能會(huì)引起STC-1升高以拮抗過多的Ca2+水平，使鈣離子代謝趨向穩(wěn)定，因?yàn)殁}離子代謝可以影響細(xì)胞能量代謝，而能量代謝也可能是STC-1直接影響所致，這種影響會(huì)反映到對細(xì)胞的抑制作用逐漸趨向平穩(wěn)甚至減弱，這也可能是腎癌細(xì)胞對索拉菲尼產(chǎn)生抵抗的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)研究提示腎癌細(xì)胞對靶向藥物產(chǎn)生的抵抗作用可能與STC-1調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)，也可能直接與STC-1相關(guān)，故STC-1可能是腎癌治療的有效靶點(diǎn)，抑制STC-1可能會(huì)逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞對靶向藥物的耐藥性。然而本實(shí)驗(yàn)僅是針對基因進(jìn)行檢測，而沒有進(jìn)行干預(yù)，而且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)脫離了全機(jī)體的綜合調(diào)控，因此只是提供一個(gè)依據(jù)；而其中深層機(jī)制的確定，可能需要培養(yǎng)耐藥細(xì)胞進(jìn)行更細(xì)致的檢測和驗(yàn)證，因此后續(xù)尚需開展深入的研究予以進(jìn)一步證實(shí)。