李曉青 陳云茹 張 曦 葉 峰 藺淑梅 李建州

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是在無慢性肝病基礎(chǔ)上短時(shí)間內(nèi)發(fā)生大量肝細(xì)胞壞死及嚴(yán)重肝功能損害，進(jìn)展迅速，病死率高，目前尚缺乏特效治療藥物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)和肝臟局部RAS的激活與脂肪肝、慢性肝炎和肝硬化密切相關(guān)，為肝臟疾病的治療提供了新的思路，但關(guān)于RAS在肝衰竭中的研究報(bào)道甚少[2,3]。阿利吉侖是第2代腎素抑制劑，能夠直接降低腎素的活性，減少血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)生成，在第一環(huán)節(jié)阻斷RAS系統(tǒng)[4]。因此推測阿利吉侖可以通過阻斷RAS對急性肝衰竭發(fā)揮保護(hù)作用。本研究通過D-GalN/LPS聯(lián)合注射誘導(dǎo)大鼠急性肝衰竭模型，采用阿利吉侖進(jìn)行干預(yù)，探討阿利吉侖對急性肝衰竭的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑：體質(zhì)量180～200g的清潔級雄性8周齡SD大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，本研究在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批后實(shí)施(倫理許可證編號：2017-606)。D-GalN與LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。阿利吉侖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。AngⅡ、血管緊張素(1-7)[angiotensin1-7，Ang(1-7)]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。RNA提取試劑、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)一抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)分組：將30只清潔級健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：①正常對照組：10只，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，30min后再次注射等量0.9%氯化鈉注射液；②肝衰竭組：10只，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(10μg/kg)；③阿利吉侖組：10只，腹腔注射阿利吉侖(25mg/kg)，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(20μg/kg)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠10h后統(tǒng)一處死，采血分離血清，同時(shí)留取肝臟右葉組織，凍存?zhèn)錂z。

3.生化指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子的檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀(型號：Rayto Chemray 240)檢測大鼠血清中的ALT、AST、LDH、ALP水平。按照試劑盒說明書采用Elisa法檢測大鼠血清或肝組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、AngⅡ、Ang(1-7)水平。

4.HE染色：獲取大鼠肝臟右葉組織后放入10%甲醛溶液中固定72h，經(jīng)組織脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、切片脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色等常規(guī)步驟，200倍光鏡下觀察肝臟病理變化并拍照。

5.TUNEL法檢測肝臟細(xì)胞凋亡：采用TUNEL法檢測大鼠肝右葉組織中肝細(xì)胞凋亡指數(shù)。在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，與細(xì)胞核重疊且呈紅色熒光的為陽性細(xì)胞。運(yùn)用凋亡指數(shù)表示，選取5個(gè)400倍鏡下視野，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)各視野的凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=各視野陽性細(xì)胞數(shù)/100×100%，每個(gè)大鼠的凋亡指數(shù)等于各視野凋亡指數(shù)的平均值。

6.熒光定量PCR分析：每組隨機(jī)選擇5只大鼠的肝右葉組織進(jìn)行檢測，采用Trizol法提取肝臟組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。β-actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴(kuò)增條帶為240bp。GRP78上游引物：5′-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3′，下游引物：5′-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3′，擴(kuò)增條帶為195bp。CHOP上游引物：5′-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3′，下游引物：5′-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3′，擴(kuò)增條帶為210bp。

7.Western blot法檢測：每組隨機(jī)選擇5只大鼠的肝右葉組織進(jìn)行檢測，用裂解液提取肝臟組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50μg樣本進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液室溫?fù)u床封閉2h。PVDF膜浸泡于封閉液稀釋的一抗中4℃孵育過夜。TBST洗膜后，PVDF膜浸泡于封閉液稀釋的二抗37℃搖床孵2h。TBST洗膜后用ECL液顯色檢測蛋白信號。用BandScan圖像軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，分別計(jì)算GRP78、CHOP與內(nèi)參β-actin的灰度值之比作為其相對含量值。

結(jié) 果

1.3組大鼠RAS關(guān)鍵分子的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清和肝臟組織的AngⅡ水平均明顯升高，肝臟組織的Ang(1-7)水平明顯下降，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清和肝臟組織的AngⅡ水平均明顯下降，Ang(1-7)水平明顯升高，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯下降(P=0.000)，詳見表1和表2。

表1 3組大鼠血清中RAS關(guān)鍵分子的變化

表2 3組大鼠肝組織中RAS關(guān)鍵分子的變化

2.3組大鼠生化指標(biāo)的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明顯下降(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 3組大鼠生化指標(biāo)的變化A.3組大鼠血清ALT的變化；B.3組大鼠血清AST的變化；C.3組大鼠血清LDH的變化；D.3組大鼠血清ALP的變化。*P<0.05，**P=0.000

3.3組大鼠炎性細(xì)胞因子濃度的變化：與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明顯升高(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明顯下降(P=0.000)，詳見圖2。

圖2 3組大鼠炎性細(xì)胞因子濃度的變化A.3組大鼠血清TNF-α的變化；B.3組大鼠血清IL-6的變化；C.3組大鼠血清TGF-β1的變化。*P<0.01，**P=0.000

4.3組大鼠肝組織病理的變化：在200倍光鏡視野下可見，與正常對照組比較，肝衰竭大鼠的肝臟組織HE染色后可見部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇淤血，大量肝細(xì)胞變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組仍可見炎性細(xì)胞浸潤和肝竇淤血，但肝細(xì)胞的變性壞死明顯減少，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，詳見圖3。

圖3 3組大鼠肝臟組織HE染色(×200)A.正常對照組；B.肝衰竭組；C.阿利吉侖組

5.3組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡的變化：在200倍熒光視野下可見，與正常對照組比較，肝衰竭大鼠的肝臟組織出現(xiàn)大量細(xì)胞核染成紅色熒光的凋亡細(xì)胞，而阿利吉侖組大鼠肝臟組織內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量較肝衰竭組明顯減少，詳見圖4。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組大鼠肝臟組織中肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯下降(P=0.000)，詳見表3。

表3 3組大鼠肝組織凋亡指數(shù)的比較

圖4 3組大鼠肝臟組織TUNEL染色(×200)A.正常對照組；B.肝衰竭組；C.阿利吉侖組

6.3組大鼠肝臟組織GRP78、CHOP表達(dá)水平的變化：熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，肝衰竭組大鼠肝臟組織中GRP78、CHOP的 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P=0.000)。與肝衰竭組比較，阿利吉侖組肝臟組織中GRP78、CHOP的 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P=0.000)，詳見圖5中A和B。Western blot法檢測結(jié)果顯示，3組大鼠肝臟組織中GRP78、CHOP蛋白的水平與mRNA的表達(dá)水平趨勢一致(P=0.000)，詳見圖5中C～E。

圖5 3組大鼠肝組織GRP78、CHOP表達(dá)水平的變化A.3組大鼠肝組織GRP78 mRNA水平的變化；B.3組大鼠肝組織CHOP mRNA水平的變化；C.3組大鼠肝組織GRP78蛋白水平的變化；D.3組大鼠肝組織CHOP蛋白水平的變化；E.3組大鼠肝組織Western blot法檢測結(jié)果。*P=0.000

討 論

RAS系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)，其發(fā)揮生物學(xué)作用主要通過兩條功能軸，即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin converting enzyme- angiotensinⅡ-angiotensinⅡ type1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R)軸和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素(1-7)- Mas受體[angiotensin converting enzyme2- angiotensin1-7- mas receptor，ACE2- Ang(1-7)-MasR]軸。既往研究表明，ACE-AngⅡ-AT1R軸參與調(diào)控多種炎癥相關(guān)的病理過程，主要發(fā)揮促炎、促氧化應(yīng)激及促凋亡等負(fù)面效應(yīng)[5～9]。而ACE2-Ang(1-7)-MasR軸作為拮抗軸，則發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡化等正面效應(yīng)[10,11]。RAS已被證實(shí)參與肝炎、肝纖維化等多種肝臟疾病的病理過程，但在肝衰竭中的具體作用機(jī)制尚不清楚[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性肝衰竭進(jìn)程中，RAS的核心效應(yīng)分子AngⅡ和Ang(1-7)呈現(xiàn)相反的變化趨勢，AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯升高，提示存在ACE-AngⅡ-AT1R軸過度激活。而阿利吉侖干預(yù)可以顯著降低ACE-AngⅡ-AT1R軸的激活水平，同時(shí)提高ACE2- Ang(1-7)-MasR軸的激活水平，從而糾正兩條功能軸失平衡狀態(tài)，發(fā)揮其保護(hù)作用。

炎癥和凋亡是急性肝衰竭進(jìn)展中肝臟的特征性病理改變[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠在10h后即出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能損傷和炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴，表現(xiàn)為血清中ALT、AST、ALP、LDH等生化指標(biāo)以及TNF-α、IL-6、TGF-β1等經(jīng)典炎性細(xì)胞因子水平的顯著升高，同時(shí)組織中可見大量肝細(xì)胞變性壞死和凋亡肝細(xì)胞。而在造模前給予阿利吉侖干預(yù)，則可以明顯減輕急性肝衰竭大鼠的肝功能損傷和炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴，同時(shí)組織中肝細(xì)胞變性壞死、凋亡明顯減少。以上研究結(jié)果表明，腎素抑制劑阿利吉侖能夠通過阻斷RAS發(fā)揮抗炎、抗凋亡效應(yīng)，對急性肝衰竭具有保護(hù)作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與各種急性或慢性的肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，包括非酒精性脂肪肝、藥物性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等[15～18]。已有研究證實(shí)，在急性肝衰竭進(jìn)程中，存在嚴(yán)重的ERS，而抑制ERS可以減輕急性肝衰竭動(dòng)物的肝功能損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖干預(yù)后肝衰竭大鼠肝臟組織中ERS標(biāo)志分子GRP78 和CHOP的表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示阿利吉侖可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用。但是，在急性肝衰竭進(jìn)程中RAS與ERS相互作用的分子機(jī)制仍有待于更深一步的研究。

綜上所述，阿利吉侖通過阻斷RAS，能夠明顯減輕急性肝衰竭進(jìn)程中的肝臟炎癥，減少肝細(xì)胞的凋亡，其保護(hù)作用可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。因此，阻斷RAS可能為急性肝衰竭的治療提供新的思路。