張 敏 王志維

心臟血管外科體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)后腦損傷主要表現(xiàn)為腦卒中、認(rèn)知功能障礙及術(shù)后譫妄。心臟外科手術(shù)體外循環(huán)后腦缺血再灌注損傷是心臟血管外科患者術(shù)后預(yù)后不良的主要因素之一[1]。有研究表明，高齡(>65歲)、女性、糖尿病史、高血壓史是影響CPB后腦缺血再灌注損傷的重要因素[2,3]。因此，降低CPB術(shù)后腦損傷的發(fā)生率，緩解CPB 術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是現(xiàn)今心臟血管外科CPB術(shù)后亟需攻克的難題。

鐵元素是人體所需微量元素中含量最高的元素之一，與人體健康和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是人體內(nèi)三羧酸循環(huán)及細(xì)胞呼吸相關(guān)酶類不可或缺的輔助因子。研究表明，在缺血條件下，大腦處于缺氧狀態(tài)，腦組織所需氧含量增加，導(dǎo)致機(jī)體腦組織對(duì)鐵元素需求增加[4]。此外，老年人作為顱內(nèi)出血的主要發(fā)病人群，去鐵胺能加速老年顱腦損傷患者顱內(nèi)血腫的吸收并抑制腦部水腫[5]。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)對(duì)維持腦組織細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)、保障鐵離子準(zhǔn)確、穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體細(xì)胞極為關(guān)鍵。現(xiàn)今，對(duì)于TF在腦缺血再灌中的作用的相關(guān)研究較為匱乏，理清鐵穩(wěn)態(tài)及相關(guān)鐵代謝蛋白在腦缺血再灌注損傷中的作用，對(duì)于臨床心臟血管外科CPB術(shù)后腦缺血再灌注損傷防治有著重要意義。

材料與方法

1.動(dòng)物模型構(gòu)建與分組：12只雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自湖北省疾病控制中心。小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)和腦缺血再灌注組(IR組)，每組6只，飼養(yǎng)于湖北省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠稱重后腹腔注射戊巴比妥(80mg/kg)進(jìn)行麻醉。待小鼠角膜反射消失后，將麻醉小鼠仰臥固定于操作臺(tái)，頸部正中切口分離右頸總動(dòng)脈(common carotid artery, CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery, ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery, ICA)和迷走神經(jīng)。近心端結(jié)扎CCA，動(dòng)脈夾夾閉右CCA遠(yuǎn)心端，顯微鏡下，在動(dòng)脈夾與近心端結(jié)扎處之間顯微鑷作一切口，插入線栓，取下動(dòng)脈夾，向ICA方向緩緩?fù)七M(jìn)。當(dāng)推入阻力顯著增強(qiáng)則立即停止插入，活結(jié)絲線固定線栓。缺血2h后拔出線栓，縫合手術(shù)切口，再灌24h。Sham組不插入線栓，其他操作與IR組一致。模型構(gòu)建完成后，預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液經(jīng)心臟灌注，除去體內(nèi)血液，以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定各組小鼠腦組織標(biāo)本，石蠟包埋切片，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：源自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞系購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，PC12細(xì)胞以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，5%馬血清(horse serum，HS)及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞缺氧復(fù)氧前棄去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，PBS洗去剩余培養(yǎng)基，加入無(wú)糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱，缺氧后換正常培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱復(fù)氧12h。其后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。通過PC12細(xì)胞缺氧復(fù)氧在體外模擬腦缺血再灌注病理生理環(huán)境，分為對(duì)照組(control組)、給予三氣培養(yǎng)箱缺氧復(fù)氧組(HR組)、Transferrin重組蛋白處理組(TF組)和Transferrin處理后進(jìn)行缺氧復(fù)氧組(HR+TF組)。

3.實(shí)驗(yàn)試劑：anti-Transferrin一抗、anti-TFR1一抗和anti-FPN1一抗均購(gòu)自武漢Proteintech生物技術(shù)公司。anti-GAPDH一抗和免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物公司。BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技公司。Tunel試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物公司。

4.免疫組化：組織切片常規(guī)脫蠟、水化。0.2%Triton破膜15min，PBS洗3次，每次5min，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3%H2O2室溫下封閉組織內(nèi)過氧化物酶，山羊血清封閉1h，封閉完畢后，血清棄去不洗，一抗4℃孵育過夜，次日清洗后，二抗室溫孵育1h。DAB顯微鏡下顯色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

5.免疫熒光：細(xì)胞爬片，按照實(shí)驗(yàn)分組要求處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗去殘留培養(yǎng)基，棄去PBS，4%多聚甲醛固定5min，PBS洗3遍，每次5min。0.2%Triton破膜10min，山羊血清封閉1h，血清棄去不洗，一抗4℃孵育過夜，洗去非特異性結(jié)合一抗。二抗常溫孵育1h，洗去非特異性結(jié)合二抗，DAPI復(fù)染，抗熒光淬滅封片劑封片，全自動(dòng)熒光顯微鏡下觀察并拍照。

6.Tunel染色：細(xì)胞爬片，按照實(shí)驗(yàn)分組要求處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗去殘留培養(yǎng)基，棄去PBS，4%多聚甲醛固定5min。按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，其后以抗熒光淬滅封片劑封片，全自動(dòng)熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

7.Western blot法檢測(cè)：細(xì)胞處理完畢后，預(yù)冷PBS洗去殘余培養(yǎng)基，胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化，收集消化所得細(xì)胞混懸液，1000r/min離心5min，棄上清。PBS重懸細(xì)胞，洗去殘余培養(yǎng)基，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量體積含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解10min。超聲后在預(yù)冷冷凍離心機(jī)內(nèi)以離心。取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴15min，蛋白樣品制備完成后凍存于-80℃冰箱。制備10%濃度的SDS-PAGE凝膠，每孔蛋白上樣量為20μg，濃縮膠電壓65V，分離膠電壓90V進(jìn)行電泳；200mA恒流電轉(zhuǎn)2h，一抗4℃孵育過夜；二抗常溫孵育1h，Odessy熒光成像系統(tǒng)掃膜，所獲條帶以Image J進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

1．腦缺血再灌注對(duì)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：通過免疫組織化可見，IR組TF表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)；IR組TFR1、FPN1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低。表明鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在腦缺血再灌過程中有著極為重要的作用(圖1)。

圖1 小鼠腦缺血再灌后TF、TFR1、FPN1的表達(dá)變化免疫組化染色，×400

2.PC12細(xì)胞系缺氧復(fù)氧對(duì)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：通過Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞缺氧復(fù)氧后，HR組TF表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)；HR組TFR1與FPN1表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致(圖2)。

圖2 PC-12細(xì)胞缺氧復(fù)氧后TF、TFR1、FPN1表達(dá)變化A.Western blot法檢測(cè)結(jié)果;B～D.分別為TF、TFR1、FPN1與內(nèi)參GADPH比值統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.TF處理后PC12活性氧情況比較：按照分組要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，收集細(xì)胞染色后行流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HR組較對(duì)照組ROS水平顯著上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TF組與對(duì)照組ROS水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HR+TF組與HR組比較，PC12中ROS水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見給予TF重組蛋白可以顯著減輕PC12細(xì)胞中由缺氧復(fù)氧所致ROS水平升高(圖3)。

圖3 TF重組蛋白處理后PC12細(xì)胞ROS水平變化A.流式結(jié)果；B.各組DHE平均熒光強(qiáng)度。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與HR組比較，#P<0.05

4.TF處理后PC12細(xì)胞凋亡情況比較：在對(duì)各組細(xì)胞行Tunel染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與TF組無(wú)明顯細(xì)胞凋亡；HR組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而HR+TF組較HR組細(xì)胞凋亡比率顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也就說明Transferrin能夠在一定程度上減輕由缺氧復(fù)氧所致的PC12神經(jīng)元細(xì)胞凋亡(圖4)。

圖4 TF重組蛋白處理后PC12細(xì)胞凋亡水平變化A.免疫熒光結(jié)果(Tuneil染色，400倍);B.各組細(xì)胞凋亡比例。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與HR組比較，#P<0.05

討 論

隨著心臟外科技術(shù)與設(shè)備的不斷發(fā)展，體外循環(huán)輔助下的心臟外科手術(shù)成功率穩(wěn)步提升。但隨著患者的年齡逐漸增加，腦缺血再灌注損傷仍然是CPB的主要并發(fā)癥[3]。因此，研究腦缺血再灌中的具體機(jī)制及可能的干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)于CPB所致的腦缺血再灌注損傷的防治極為重要。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)，短暫性前腦缺血(transient forebrain ischemia,TFI)后，鐵超載會(huì)導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生和海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞延遲性死亡(delayed neuronal death，DND)。與此同時(shí)， Zhao等[7]通過體內(nèi)外模型研究證實(shí)，裝載番茄紅素的納米脂質(zhì)體顆?？梢源龠M(jìn)TF的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平，抑制炎性細(xì)胞因子分泌，降低活性氧產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受腦缺血再灌損傷。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥與腦損傷后鐵代謝也有諸多研究成果。葛等通過大鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)，腦泰方可以降低腦出血所致神經(jīng)元細(xì)胞鐵超載水平，增加細(xì)胞抗氧化能力，減輕細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。與此同時(shí)，郭純等[9]研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_方可以通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)TF與TFR的表達(dá)，降低神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平，防止鐵超載，進(jìn)而起到腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用。可見鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)于腦損傷相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有極其重要的作用。正常情況下，鐵穩(wěn)態(tài)受到鐵代謝相關(guān)蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，因此鐵代謝調(diào)控相關(guān)蛋白極可能是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要節(jié)點(diǎn)。

鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關(guān)蛋白主要包括TF、TFR1、FPN1等。鐵離子主要經(jīng)由小腸吸收，在體內(nèi)通過與TF結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，TF與細(xì)胞膜上的TFR1及TFR2結(jié)合，形成TF-TFR復(fù)合體，通過細(xì)胞膜內(nèi)吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)部分鐵離子維持參與細(xì)胞正常生理功能，部分鐵以鐵蛋白的形式貯存于細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而參與到細(xì)胞正常的生理活動(dòng)之中。鐵離子進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)由FPN1轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，主要來(lái)源于肝臟的鐵調(diào)素可以調(diào)控FPN1的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鐵代謝的動(dòng)態(tài)調(diào)控[4]。關(guān)于鐵代謝相關(guān)蛋白在缺血再灌注損傷中的表達(dá)及作用尚不明確，因此，本研究通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在缺血再灌注環(huán)境下，鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化及其對(duì)缺血再灌注損傷所造成的影響。

本研究通過免疫組化檢測(cè)了參與鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)變化?？梢奣F在IR組表達(dá)較Sham組顯著增多。TFR1、FPN1表達(dá)在IR組較Sham組表達(dá)明顯降低。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)PC12細(xì)胞系進(jìn)行缺氧復(fù)氧發(fā)現(xiàn)TF、TFR1及FPN1表達(dá)變化與在體腦缺血再灌基本一致。鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控過程中，TF表達(dá)增多導(dǎo)致鐵轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)增多或FPN1的表達(dá)降低導(dǎo)致鐵轉(zhuǎn)出減弱，是否是所致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鐵超載主要原因需要進(jìn)一步研究。有研究表明，空載的TF可以結(jié)合胞外游離Fe3+，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)并有利于呼吸衰竭的恢復(fù)[10]。Fe3+自身氧化還原特性對(duì)于ROS的產(chǎn)生極為重要，ROS積聚會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷。因此降低細(xì)胞外Fe3+濃度，減輕Fe3+的細(xì)胞氧化毒性對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)極為重要[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TF表達(dá)增高，推測(cè)其可能通過結(jié)合細(xì)胞外游離的Fe3+，降低胞外Fe3+的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而對(duì)PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[12,13]。ROS水平升高與細(xì)胞凋亡增多是缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度的主要指標(biāo)，為了驗(yàn)證TF在腦缺血再灌注損傷中的作用，筆者檢測(cè)各組PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平，通過Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率發(fā)現(xiàn)，HR組細(xì)胞ROS水平及細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組顯著增高，HR組+TF組較HR組細(xì)胞活性氧水平顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著減少?？梢娫赥ransferrin重組蛋白處理細(xì)胞后，其可能通過結(jié)合培養(yǎng)基中的Fe3+，降低胞外游離Fe3+的濃度，并在一定程度上降低缺氧復(fù)氧所致PC12內(nèi)的ROS水平，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡率[14]。

綜上所述，空載TF可以通過降低胞外Fe3+濃度，減少ROS積聚減輕CPB后腦損傷，針對(duì)CPB后腦損傷高危患者，通過外源性輸注適量單位的TF或許對(duì)于CPB輔助心臟外科術(shù)后腦損傷的防治具有積極作用[15,16]。本研究通過體外細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，在缺氧復(fù)氧條件下TF能降低PC12細(xì)胞系內(nèi)ROS水平，同時(shí)減少細(xì)胞凋亡，對(duì)于TF應(yīng)用于CPB后腦損傷提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足，主要是未在體外模型中研究TF對(duì)腦缺血再灌注損傷的效果進(jìn)行評(píng)估。再者，未評(píng)估TF對(duì)于機(jī)體其他組織器官的正常功能是否有影響，這些也是后續(xù)研究的內(nèi)容[17,18]。