李建剛 李亮 帕合熱迪尼·玉素莆 馬博

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一，中晚期病人療效不佳，預后差[1]。腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是腫瘤復發(fā)、侵襲、轉移及耐藥的根源，已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)CSCs的存在[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs參與調控胃癌干細胞(gastric cancer stem cells,GCSCs)的惡性生物學行為[3]。miR-711是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在多種惡性腫瘤組織中低表達[4-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-711能抑制SGC-7901細胞的干性指標SOX2的表達，同時抑制與腫瘤耐藥相關的基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達[7]。我們從TCGA及Metabolic gEne Rapid Visualizer等數(shù)據(jù)庫分析顯示胃癌組織和胃癌細胞株中miR-711低表達，正常胃黏膜組織中miR-711高表達。但是miR-711是否可影響GCSCs的干性目前尚不清楚。本研究分析miR-711對GCSCs干性特征的影響。

材料與方法

一、主要試劑、細胞株及儀器

人胃癌干細胞CSC-G、人胃癌細胞株 MKN-45(美國ATCC細胞庫)。RPM11640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(Gibco，美國)；miR-711 mimics、miR-NC對照質粒、引物序列、MUT-CD44和 WT-CD44(上海生物工程公司)；兔抗人Bmi1、Sox2、Oct4、CD44、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Jackson公司，美國)；熒光素酶檢測試劑盒(BioVision公司，美國)；Western Blot試劑盒，LipofectAMINE 2000脂質體轉染試劑盒(上海碧云天生物公司)；PCR試劑盒(Sigma公司，美國)；酶標儀(上海儀電分析儀器有限公司)；SDS-PAGE 凝膠電泳及轉移裝置(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)，LAS400凝膠成像系統(tǒng)(GE公司，美國)；ABI 7900PCR擴增儀(上海儀電分析儀器有限公司)。

二、方法

1.癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集：從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA，2020年11月)的門戶下載了1 053個胃癌組織和89個正常胃黏膜組織的miRNA數(shù)據(jù)。

2.細胞培養(yǎng)：用含10% FBS和青、鏈霉素各100 U/L的RPM11640培養(yǎng)基培養(yǎng)MKN-45，無血清RPM11640培養(yǎng)基培養(yǎng)CSC-G，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基、傳代。

3.細胞轉染：使用Lipofeetamine 2000試劑對CSC-G細胞進行轉染，分為：miR-NC組(轉染miR-NC)，miR-711組(轉染miR-711-mimics)及CSC-G組(未轉染)。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時，用于后續(xù)實驗。

4.實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測各組細胞miR-711 mRNA表達：取轉染后培養(yǎng)48小時的各組細胞，胰酶消化，離心。加入Trizol提取細胞總RNA，檢測合格后將RNA轉錄成cDNA進行PCR。引物序列見表1。反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl+上下游引物10 μm各1 μl，加反應水至總體積為25 μl。反應參數(shù)：95 ℃預變性4分鐘；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，30個循環(huán)，72 ℃延伸10分鐘。讀取熒光，構建溶解曲線。2-△△Ct法計算目標引物mRNA的相對表達量。

表1 目標引物序列和大小

5.Western Blot檢測Bmi1、Sox2、Oct4及CD44蛋白量表達：取轉染后培養(yǎng)48小時的各組細胞，去除培養(yǎng)基后每空加入500 μl蛋白裂解液進行，超聲裂解30分鐘，40 ℃ 1 500 r/min離心5分鐘，把上層液體10 μl移入EP管中，蛋白濃度檢測。配膠，上樣，電泳，經(jīng)濕轉將蛋白轉移至 PVDF 膜，封閉液封閉1小時，逐次兔抗人Bmi1(1∶500)、Sox2(1∶500)、Oct4(1∶1 000)、CD44(1∶500)、β-actin(1∶1 000)多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(1∶100)。曝光成像，Quantity One V4軟件進行分析。結果以目標蛋白光密度值/β-actin光密度值表示。

6.懸浮腫瘤球形成實驗檢測CSC-G干性：將各組細胞接種于96孔板中，細胞濃度調整為5×102個/孔，加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基200 μl，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，每天觀察腫瘤球數(shù)量，培養(yǎng)2周時，顯微鏡下拍照。

7.熒光素酶實驗驗證miR-711與CD44的靶向關系：參照脂質體轉染說明書將CD44野生型或突變型的熒光素酶報告基因質粒載體與miR-NC、miR-711-mimic一起轉入細胞，培養(yǎng)48小時，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行檢測。

三、統(tǒng)計學方法

結果

1.人胃癌組織中miR-711的表達見圖1。利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了miR-711在人胃癌組織的表達水平，結果顯示，與正常胃黏膜組織相比，miR-711在胃癌組織中的表達水平更低，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

與胃癌組織比較，a P<0.000 1

2.各組miR-711 mRNA表達：見圖2。與miR-711組比較，CSC-G組、MKN-45組、miR-NC組細胞miR-711平降低(P<0.01)；與MKN-45組比較，CSC-G組細胞miR-711水平降低(P<0.01)。

與miR-711組比較，a P<0.01；與MKN-45組比較，b P<0.01

3.過表達miR-711對CSC-G細胞腫瘤球形成能力的影響見圖3。培養(yǎng)1周、2周時，miR-711組懸浮細胞球百分比低于CSC-G組、miR-NC組(P<0.01)，且細胞球形態(tài)較小。說明miR-711過表達抑制了干細胞的腫瘤球形成能力。

A:培養(yǎng)1周、2周各組腫瘤球形成情況(×20)；B:統(tǒng)計學分析。與miR-711組比較，a P<0.01

4.miR-711過表達對Bmi1、Sox2、Oct4蛋白及基因mNRA表達的影響見圖4。miR-711組Bmi1、Sox2、Oct4蛋白及基因mNRA水平低于CSC-G組、miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

5.miR-711與CD44的靶向關系見圖5。生物信息分析，miR-711與CD44存在一定的互補堿基對。miR-711組CD44蛋白及mNRA水平低于CSC-G組、miR-NC組(P均<0.01)與WT-CD44組相比，miR-711+WT-CD44組細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)。

討論

胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，盡管手術、放療、化療及免疫靶向治療等手段取得了長足的進步，但胃癌的復發(fā)轉移問題仍未得到解決。CSCs是一群具有多向分化能力、無限增殖能力的細胞，被認為是腫瘤轉移復發(fā)的根本原因[8]。近年來，已從多種惡性腫瘤組織及細胞株中分離出CSCs，并證實了其生物學性能[9]。研究顯示，胃癌中同樣存在腫瘤干細胞[10]。因此，抑制CSCs的干細胞特性對于預防胃癌的轉移復發(fā)，提高病人的預后具有重要意義。

研究顯示，miRNAs與腫瘤干細胞的增殖、侵襲、轉移及多向分化密切相關，miR-196a-5p通過靶向Smad4基因抑制GCSCs的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和侵襲過程[11]，miR-876-3p可靶向TMED3基因增強胃癌細胞的順鉑敏感性，抑制干細胞特征[12],以及miR-7-5p 可靶向上調Smo、Hes1基因,促進GCSCs的侵襲[13]。因此，miRNAs可通過CSCs成為胃癌的有意義的治療靶點。miR-711作為一種抑癌基因，與多種腫瘤細胞的惡性行為有關。Xiao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-711在胃癌組織中低表達，可靶向CD44調控胃癌細胞的EMT過程。但其對GCSCs特性的影響尚不清楚。本研究分析了miR-711在胃癌細胞及CSC中的表達，結果顯示，miR-711在CSC細胞中的表達水低于胃癌細胞株細胞中的表達水平，表明miR-711在胃癌CSC中是一種抑癌因子。為探索miR-711是否調控胃癌CSC的干性，我們將miR-711轉染至CSC中，觀察干細胞的腫瘤球形成能力的改變，結果顯示，過表達miR-711組細胞的腫瘤球形成能力低于其他兩組，提示miR-711可抑制GCSCs腫瘤球形成能力。Bmil、Sox2、Oct4作為腫瘤干細胞標志物，是維持干細胞干性所必需的。有研究證實，GCSCs同樣高表達Bmil、Sox2、Oct4蛋白[15]。基于此，本研究中我們選擇Bmil、Sox2、Oct4進行研究，Western Blot及q-PCR結果均表明，上調miR-711后，胃癌干細胞CSC-G中Bmil、Sox2、Oct4表達均顯著降低。以上結果說明，過表達miR-711可抑制GCSCs的干性特性。

A、B:Western Blot結果；C:mNRA表達;與miR-711組比較，a P<0.01

A:生物信息分析結果；B:CD44蛋白及mNRA表達結果；C:熒光素酶實驗；D:Western Blot結果。與miR-711組比較，a P<0.01；與WT- CD44組比較，b P<0.01

在觀察到過表達miR-711抑制CSC-G細胞干性后，還需要進一步研究其具體機制。miRNAs調控下游靶基因的方式主要是通過與基因mRNA的3'UTR區(qū)結合完成。我們通過在線生物信息網(wǎng)站預測到miR-711的靶基因存在上百個，其中CD44屬于干細胞標記物，在多種腫瘤組織中高表達，在干細胞干性維持中發(fā)揮重要的作用[16-18]。尹磊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌間質干細胞可通過Wnt /β-catenin通路激活下游CD44蛋白的表達進而促進癌細胞的侵襲。劉罡等[20]研究結果顯示，miR-34a可靶向調控CD44 抑制肺癌干細胞腫瘤成球、侵襲能力。因此我們推測miR-711可能通過靶向下調CD44 抑制GCSCs的干性，首先，Western Blot及q-PCR結果均表明，上調miR-711后，胃癌干細胞CSC-G中CD44表達均顯著降低。同時雙熒光素酶實驗結果表明，CD44為miR-711直接調控的靶基因。但其深人的作用機制需在后續(xù)研究中進行探討。

綜上所述，miR-711過表達可抑制胃癌CSC的干性特征，其初步機制可能是與下調CD44有關，提示miR-711有望成為胃癌治療的有效靶點。但本次研究為初步探索，miR-711對胃癌干細胞的其他生物學行為的影響及機制需要更深入、全面研究。