李欣 林明哲 趙久達(dá)

胃癌是一種惡性腫瘤。在腫瘤增長的過程中，由于內(nèi)部血流灌注不足，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧消耗大于供給，從而產(chǎn)生缺氧，形成低氧微環(huán)境。細(xì)胞對于低氧應(yīng)激的關(guān)鍵信號通路是低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)信號通路[1-3]。HIF與腫瘤的血管生成、增殖、侵襲及產(chǎn)生耐藥性等都具有緊密的聯(lián)系[4-8]。HIF家族主要由HIF-1、HIF-2和HIF-3構(gòu)成。HIF家族主要是由α和β亞基組成的異源二聚體，其中調(diào)控低氧的的主要功能亞基是α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)[9-13]。本文選取HIF-1α代表HIF家族來研究HIF在胃癌病人中的表達(dá)以及與預(yù)后的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

2015年9月～2017年7月在我院治療的胃癌病人62例，均行胃癌根治術(shù)。其中男性36例，女性26例，年齡56～68歲，平均年齡(58.0±5.8)歲，均為開腹手術(shù)。由外科醫(yī)生提供胃癌原發(fā)灶組織以及距胃癌原發(fā)灶邊緣5 cm的癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)之前均未進(jìn)行過化療和放療；(2)腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病病人；嚴(yán)重肝腎功能障礙。

二、方法

1.免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)染色鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin peroxidase，SP)法檢測HIF-1α在胃癌組織及正常胃組織中的表達(dá)情況。石蠟切片常規(guī)脫水后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，封閉非特異性位點；滴加一抗，4 ℃孵育過夜置于室溫，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃溫箱內(nèi)孵育35分鐘；PBS沖洗后滴加SP復(fù)合物，37 ℃溫箱內(nèi)孵育30分鐘；PBS沖洗，二甲基聯(lián)苯胺顯色5分鐘；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染10分鐘；自來水沖洗10分鐘，鹽酸酒精分化2～3秒；自來水沖洗，溫水浸泡返藍(lán)30分鐘；脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5分鐘；中性樹脂封片。采用已知的HIF-1α陽性表達(dá)的胃癌切片作為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.高效液相色譜法：將胃癌和癌旁組織的經(jīng)過苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，體積比) 法提取組織 DNA，再將DNA經(jīng)過酶解后采用色譜柱為Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);流動相為0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸;流速為1.3 ml/min;檢測波長為273 nm；進(jìn)行HPLC分析，計算得出DNA甲基化水平。

3.表達(dá)分析：采用獨立樣本t檢驗以及bootstrap方法檢驗比較胃癌組織與癌旁組織之間HIF-1αmRNA及DNA甲基化的表達(dá)差異，并用Pearson對兩者差異進(jìn)行相關(guān)性分析。

4.生存分析：以接受者操作特性(receiver operating characteristiccurve，ROC)曲線的約登指數(shù)最小值(總生存分析和無復(fù)發(fā)生存分析分別為1.421和3.386)作為HIF-1αmRNA表達(dá)的分割點，將胃癌病人分為HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組；繪制出總生存生存曲線和無復(fù)發(fā)生存曲線，采用Kaplan-Meier法；再分別比較兩組之間的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率，方法選擇采用對數(shù)秩和檢驗(Log-rank)。

5.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定：HIF-1α蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀。由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法對切片進(jìn)行觀察，每張切片隨機(jī)選擇10個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數(shù)100個細(xì)胞。采用半定量積分法判斷HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。依據(jù)染色強(qiáng)度評分：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞<5%為0分，5%≤陽性細(xì)胞<25%為1分，25%≤陽性細(xì)胞<50%為2分，陽性細(xì)胞≥50%為3分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)，其中弱陽性(+)、中等陽性(++)及強(qiáng)陽性(+++)均為陽性。

6.觀察指標(biāo)：比較胃癌組織和正常胃組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，比較不同臨床特征胃癌病人胃癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。隨訪3年，第1次入院便開始隨訪，第1年每3個月隨訪1次，以后2年每6個月隨訪1次。統(tǒng)計病人生存情況。病人總生存期是指對病人進(jìn)行隨訪期間病人死亡或者隨訪結(jié)束。比較胃癌組織中HIF-1α蛋白陽性表達(dá)和陰性表達(dá)病人的生存率。根據(jù)隨訪情況，將病人分為生存組與死亡組，比較兩組病人胃癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。分析胃癌組織中HIF-1α蛋白表達(dá)情況與胃癌病人臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Graphad Prism 5.0軟件作圖。HIF-1α蛋白以及DNA甲基化的表達(dá)水平采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法；對數(shù)秩和檢驗(Log-rank)分析組間生存率差異。檢驗水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

結(jié)果

1.HIF-α的mRNA表達(dá)水平與DNA甲基化水平：HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)及DNA甲基化情況與癌旁組織相比，HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)水平較低，癌旁組織與癌組織的表達(dá)量分別為(4.80±0.29)和(3.09±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.369，P<0.05)(圖1，表1)，而其中DNA甲基化水平則偏高，正常與癌組織的表達(dá)量分別為(0.158±0.010)和(0.362±0.009)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.806，P<0.05)(圖2，表1)。說明DNA甲基化水平與癌組織的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。再通過Pearson分析法分析HIF-1α蛋白表達(dá)與其DNA甲基化水平之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.46，P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明，胃癌中HIF-1α表達(dá)下降，推測應(yīng)該與其DNA甲基化水平升高具有一定的相關(guān)性，同時，HIF-1α的表達(dá)與DNA甲基化水平的表達(dá)水平的高低在臨床方面可以體現(xiàn)出腫瘤的侵襲程度。

圖1 HIF-1α在癌旁組織和胃癌組織中的mRNA表達(dá)水平

圖2 HIF-1α在癌旁組織和胃癌組織中的DNA甲基化水平

圖3 HIF-1α的表達(dá)水平與DNA甲基化表達(dá)水平的關(guān)系

表1 HIF-1α與DNA甲基化水平在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.胃癌組織和癌旁組織中HIF-1α因子表達(dá)情況的比較：免疫組化結(jié)果顯示HIF-1α因子主要定位于胃細(xì)胞核及核周，呈棕色顆粒狀或灶性分布;胃癌組織大部分能被染色，癌旁組織只有少部分被染色，且胃癌組織胃細(xì)胞均著色較深，呈深棕色。提示胃癌組織中HIF-1α因子的表達(dá)量均高于癌旁組織。在所收集的62例胃腺癌組織和癌旁組織中，與癌旁組織相比，有70．97%(44 /62)胃癌組織存在不同程度的HIF-1α因子表達(dá)水平的上調(diào)。

3.不同臨床特征胃癌病人胃癌組織中HIF-1α因子表達(dá)情況的比較：對免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，62例胃癌病例的胃癌組織中HIF-1α因子的表達(dá)水平與病人的年齡及性別無顯著性相關(guān)(P>0.05)，但是與腫瘤直徑和胃癌不同的發(fā)病部位以及TNM分期有顯著相關(guān)(P<0.05)。HIF-1α因子表達(dá)率的越高，腫瘤越大，并且HIF-1α因子在胃體部腫瘤的高表達(dá)率要顯著高于胃竇和賁門(表2)。以上結(jié)果提示HIF-1α因子在胃癌組織中的表達(dá)對腫瘤的發(fā)展、浸潤程度有促進(jìn)作用，并且在不同部位的胃癌中可能存在表達(dá)差異。

表2 HIF-1αmRNA的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

4.HIF-1α表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的相關(guān)性：62例病人均獲得隨訪資料。本研究將胃癌病人分為HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組；采用Kaplan-Meier法繪制總生存曲線及無復(fù)發(fā)生存曲線；對數(shù)秩和檢驗(Log-rank)分別比較HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率。結(jié)果表明，HIF-1α低表達(dá)組的總生存率(HR=0.601，P=0.002)(圖4)和無復(fù)發(fā)生存率(HR=0.498，P=0.003)(圖5)均顯著高于HIF-1α高表達(dá)組。結(jié)果顯示，HIF-1α高表達(dá)可以作為胃癌病人的不良預(yù)后的參考指標(biāo)。

圖4 HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存率

圖5 HIF-1α高表達(dá)組和低表達(dá)組的無復(fù)發(fā)生率

討論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，在腫瘤惡化的過程中耗氧量比較大，腫瘤組織處于缺氧狀態(tài)，而HIF-1α對其有一定的調(diào)節(jié)功能[14]。本研究結(jié)果表明，胃癌組中HIF-1α基因表達(dá)量高于癌旁組織，所以在臨床方面可以通過HIF-1α的表達(dá)水平來推測出腫瘤的侵襲程度[15-18]。有研究表明，腫瘤局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移離不開低氧微環(huán)境的作用。普遍認(rèn)為，低氧微環(huán)境是腫瘤生長的最終結(jié)果。以低氧調(diào)控因子為代表，可通過調(diào)控血管生成、免疫應(yīng)答和糖酵解等信號，使得在低氧微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力提高，并對放化療產(chǎn)生抵抗作用。也有研究表明，低氧條件下存在小部分低氧誘導(dǎo)蛋白可以抑制腫瘤生長[19-20]。

免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α主要定位于胃細(xì)胞核及核周，相比于癌旁組織的表達(dá)量較大，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計顯示，胃癌組織中HIF-1α的表達(dá)水平與病人的年齡及性別無明顯相關(guān)，但是與腫瘤直徑和胃癌不同的發(fā)病部位有顯著相關(guān)。HIF-1α蛋白表達(dá)率越高，腫瘤越大，并且HIF-1α在胃體部腫瘤的高表達(dá)率要顯著高于胃竇和賁門。以上結(jié)果提示，HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)對腫瘤的發(fā)展、浸潤程度有促進(jìn)作用，并且在不同部位的胃癌中可能存在表達(dá)差異。

由于選擇樣本數(shù)量較小，參照bootstrap方法檢驗統(tǒng)計是否顯著，需要根據(jù)bootstrap方法得到的95%置信區(qū)間來判斷。本研究結(jié)果表明，HIF-1α在胃癌組織和癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者間DNA甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分析HIF-1α表達(dá)與其DNA甲基化水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此推測，HIF-1α表達(dá)降低，可能與其DNA甲基化水平升高有關(guān)。通過ROC曲線分析可知，HIF-1α高表達(dá)可預(yù)示胃癌病人不良預(yù)后,還可以判斷出腫瘤的發(fā)展以及浸潤程度。

有研究表明，在腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散及血管形成中HIF-1α發(fā)揮著重要的作用，HIF-1α的高表達(dá)與腫瘤的惡化還有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。對病人近3年的觀察表明，胃癌病人HIF-α高表達(dá)者生存率為79.8%，而HIF-1α低表達(dá)者生存率僅為56.2%，低表達(dá)率病人明顯生存率偏高。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，在幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)相關(guān)胃炎和胃腺癌中檢測HIF-1α的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜中HIF-1α不表達(dá)，而由HP相關(guān)胃炎轉(zhuǎn)變成胃癌的胃黏膜中，HIF-1α的染色強(qiáng)度增強(qiáng)，密度增加。這表明胃癌的演變可能伴隨著HIF-α的參與。伴隨胃癌演變的惡劣，HIF-1α的表達(dá)也在不斷增加，同時，HIF-1α在胃癌中的表達(dá)提高，也會加劇胃癌的惡化程度。因此，對HIF-1α的表達(dá)進(jìn)行檢測可以幫助了解胃癌的的發(fā)展程度，對預(yù)后的判斷可以提供有效的參考價值。

綜上所述，HIF-1α在人體的不同種類腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，在維持腫瘤細(xì)胞的代謝過程、腫瘤血管的形成、還有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中扮演著重要的角色。并且在胃癌組織中高表達(dá)，可能會加速胃癌擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，可以作為治療腫瘤的一項參考指標(biāo)，同時對病人的預(yù)后也可以提供有效的參考價值。所以，研究HIF-1α對研究腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散、以及治療方案還有對胃癌病人的預(yù)后判斷等方面具有良好意義。