陳新秋，鄭 婭

(1永康市中醫(yī)院·浙江 永康 321300；2寧波市康復(fù)醫(yī)院·浙江 寧波 315043)

近年來，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率和病死率逐漸增高，且發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國每年的新增腦卒中病例超過200萬，其中缺血性卒中超過60%。腦卒中發(fā)生后，約3/4 的患者出現(xiàn)不同程度的后遺癥[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusiorc inhury, CIRI)是指在腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，腦功能不但沒有好轉(zhuǎn)，而且出現(xiàn)嚴(yán)重功能障礙的現(xiàn)象[2],是缺血性卒中的重要環(huán)節(jié)。莪術(shù)具有行氣破血、消積止痛之功效，為臨床上常用的活血化瘀藥[3]。已有研究表明，莪術(shù)對腦缺血模型大鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，然而莪術(shù)發(fā)揮對CIRI的保護(hù)作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過制備MCAO大鼠模型，從抗炎和抗凋亡的角度，探究莪術(shù)對MCAO大鼠CIRI的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探究其分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～240 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012。

1.2 藥物和試劑 莪術(shù)飲片，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供。將1 kg莪術(shù)飲片在冷水中浸泡過夜后，煎煮2次，過濾，濃縮至含生藥量為2 g·mL-1。水合氯醛、生理鹽水：美國Sigam公司；TNF-α、IL-1β、IL-6檢測試劑盒：上海澤葉生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；TUNEL染色試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體(SIRT1、FoxO1、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、GAPDH)：均購自美國CST公司。

1.3 主要儀器 BSA2202S型電子天平：浙江納德科學(xué)儀器有限公司；ECLIPSE TS100型顯微鏡：日本Nikon公司；L500型臺式離心機(jī)：湖南相儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；STS-8A-A型轉(zhuǎn)移脫色搖床：上海琪特分析儀器有限公司；RM-2245型切片機(jī)：德國萊卡公司；Power Pac電泳儀：美國Bio Rad公司；3300 Mini型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：中國CLinX公司。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 40只大鼠，根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法制備腦缺血再灌注(MCAO)大鼠模型，另設(shè)8只為假手術(shù)組。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同造模組。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：由尾部將大鼠提起，保持懸空，左前肢屈曲內(nèi)收，活動時(shí)呈典型追尾征。按上述標(biāo)準(zhǔn)選取32只造模成功的大鼠，隨機(jī)分成4 組，分別為模型組，莪術(shù)低、中、高(4、8、16 g·kg-1)劑量組，每組8 只，各組于每日上午8：30進(jìn)行灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水，持續(xù)14 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 神經(jīng)功能評分 給藥結(jié)束后，根據(jù)Zea Longa評分[7]標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分。

2.2.2 腦含水量測定 將各組大鼠麻醉后斷頭、取腦，去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織，即為腦濕重，110 ℃恒溫烘烤48 h后稱重即為腦干重；根據(jù)公式計(jì)算腦含水量：腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

2.2.3 腦梗死體積測定 采用TTC染色法測定腦梗死體積。取腦后在-20 ℃下放置30 min，除去小腦和嗅球，冠狀切片。隨后將腦組織切片放入1% 的TTC磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育5 min，待顏色分明后取出(梗死區(qū)呈白色)，用10%甲醛固定。利用Image Pro-Plus測量梗死面積和整個大腦面積，體積=面積×厚度，根據(jù)腦梗死體積計(jì)算腦梗死率。腦梗死率=(梗死體積/整個大腦體積)×100%。

2.2.4 腦組織炎癥因子含量測定 采用商品化ELISA檢測試劑盒檢測大鼠缺血測腦組織中相關(guān)炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的含量，具體操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

2.2.5 腦組織病理學(xué)改變觀察 HE染色觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變，取腦后置于冰上取部分腦組織，采用常規(guī)的石蠟包埋方法制備石蠟切片，隨后脫蠟水化處理，嚴(yán)格按照HE染色試劑盒的產(chǎn)品說明書進(jìn)行染色，固定封片后在顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)改變。

2.2.6 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡 用制備好的腦組織石蠟切片，進(jìn)行TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說明書步驟染色，顯微鏡下觀察(×400)，在每張病理切片中的缺血邊緣區(qū)域選擇5個視野，將胞漿中帶有棕黃色底物的細(xì)胞視作陽性凋亡細(xì)胞，利用Image-Pro plus圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)其中TUNEL陽性細(xì)胞個數(shù)，取其平均值作為該樣本的陽性細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞百分率(%)=陽性凋亡細(xì)胞數(shù)/(陽性凋亡細(xì)胞數(shù)+陰性凋亡細(xì)胞數(shù))×100%。

2.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 取部分大鼠患側(cè)腦皮質(zhì)組織，加入適量液氮，用研缽研磨后加入Lysis Buffer，組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，使組織盡量碾碎，冰上靜置裂解15～30 min。將勻漿液放入離心管中3 000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，處理蛋白隨后上樣。用SDS-PAGE分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將一抗(SIRT1、FoxO1、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、GAPDH)用5%脫脂奶粉進(jìn)行稀釋(稀釋比例為1∶1 000)，加到PVDF膜上，于4 ℃孵育過夜，然后用二抗室溫孵育2 h后顯影。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、腦含水量、腦梗死率比較 見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量、腦梗死率比較

3.2 各組大鼠腦組織炎癥因子含量測定結(jié)果比較 見表2。

表2 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

3.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)形態(tài)觀察 假手術(shù)組腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無明顯異常病變。模型組大鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞間隙增大，胞體腫脹變形，排列紊亂，核仁變淺或缺失，呈現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。與模型組相比，莪術(shù)各劑量組均能改善神經(jīng)元的病變程度，且隨著劑量的增大，改善效果越明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)形態(tài)變化(HE，×200)

3.4 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡比較 見圖2。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，與模型組相比，莪術(shù)中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

3.5 各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果比較 見圖3。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠SIRT1蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05或0.01)，F(xiàn)oxO1、Bax、Caspase-3、Caspase-8以及Caspase-9蛋白較假手術(shù)組顯著上調(diào)(P<0.05或0.01)。與模型組相比，莪術(shù)加藥組能夠明顯上調(diào)SIRT1和Bcl-2蛋白表達(dá)，明顯下調(diào)FoxO1、Bax、Caspase-3、Caspase-8以及Caspase-9蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖3 各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果

4 討論

CIRI是缺血性腦血管疾病的主要病理過程，能夠通過激活凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體損傷等途徑造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷[8-9]，其中細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)在CIRI中發(fā)揮著重要的作用。中醫(yī)藥在調(diào)控炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡方面有著獨(dú)特作用[10]。本研究通過制備MCAO大鼠模型，從抗炎和抑制凋亡兩個角度探究莪術(shù)對CIRI的保護(hù)作用。神經(jīng)功能評分已被視為藥物研究中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是評價(jià)藥效的重要依據(jù)[11]。本研究采用Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評估，結(jié)果顯示莪術(shù)干預(yù)組大鼠的評分較模型組顯著降低，表明莪術(shù)能夠改善MCAO大鼠的神經(jīng)損傷。

腦水腫和腦梗死是腦缺血再灌注的主要并發(fā)癥[12-13]，腦水腫會引起腦部機(jī)械性壓迫，使顱內(nèi)壓異常增高，從而加重腦損害。腦缺血初期常伴隨著腦梗死，造成腦梗死的原因主要是由于腦部供血不足或者血流中斷，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦含水量和腦梗死率顯著升高，表明MCAO大鼠已產(chǎn)生明顯的腦水腫和腦梗死。而經(jīng)莪術(shù)干預(yù)后，大鼠的腦含水量以及腦梗死率均得到不同程度上的降低。表明莪術(shù)能夠有效改善CIRI引起的腦水腫和腦梗死。

抑制炎癥反應(yīng)是治療腦缺血疾病的一個重要機(jī)制[14]，TNF-α、IL-1β、IL-6是主要的炎癥因子，本研究通過檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 3 種炎癥因子的含量變化，驗(yàn)證炎癥反應(yīng)在莪術(shù)保護(hù)大鼠CIRI中的作用。結(jié)果顯示，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著升高，表明MCAO大鼠已經(jīng)產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，而相對于模型組，莪術(shù)干預(yù)組大鼠中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著下調(diào)，表明莪術(shù)有效抑制了CIRI引起的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是CIRI引起神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因[15]，本研究中TUNEL染色結(jié)果表明，模型組大鼠細(xì)胞凋亡率明顯增加，而莪術(shù)能夠有效抑制CIRI誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示莪術(shù)能夠下調(diào)Bax、Caspase-3、Caspase-8以及Caspase-9蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白層面驗(yàn)證了莪術(shù)的抑制凋亡作用。

沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator protein, SIRT1)屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴的類組蛋白去乙?；福诔扇四X中普遍存在。研究證實(shí)，SIRT1的表達(dá)與神經(jīng)發(fā)育、記憶、代謝以及神經(jīng)保護(hù)等密切相關(guān)[16]。插頭盒蛋白O1(forkhead box O1 protein, FoxO1)是O-box家族插頭轉(zhuǎn)錄因子的成員，其活性受乙?；?、磷酸化和泛素化調(diào)節(jié)[17]。SIRT1/ FoxO1通路在改善肝臟損傷，改善胰島素抵抗等發(fā)揮著重要作用，目前有文獻(xiàn)指出，SIRT1/ FoxO1通路在CIRI中也有著重要的作用[2]。然而，莪術(shù)對SIRT1/FoxO1通路在CIRI方面的研究報(bào)道尚不多見。本研究結(jié)果表明，莪術(shù)能夠顯著上調(diào)MCAO大鼠腦組織SIRT1蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)FoxO1蛋白表達(dá)，作用效果具有劑量依賴性。表明莪術(shù)對CIRI的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控SIRT1/FoxO1通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，莪術(shù)能夠通過調(diào)控SIRT1/FoxO1通路，降低炎癥因子的表達(dá)以及抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)大鼠的腦缺血再灌注損傷。