畢煥洲，馬順?biāo)?，?超，李 純，姜美嫻

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(龍崗)·深圳 518172；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院·湖北 十堰 442008；3 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院·遼寧 大連 116001；4遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院·遼寧 沈陽(yáng) 110034)

睪丸是微波輻射的靶器官，手機(jī)、筆記本電腦、wi-fi等微波過(guò)度暴露，即可使睪丸生精細(xì)胞受損，光鏡下可見(jiàn)睪丸中生精細(xì)胞大量減少甚至消失、精子數(shù)量過(guò)少，導(dǎo)致男性不育癥[1-2]，又可以使生殖細(xì)胞之外的睪丸微環(huán)境受損，導(dǎo)致睪酮降低，從而影響性功能[3-4]。微波輻射的中醫(yī)證候?qū)W研究表明，微波輻射為火熱之邪，先傷肺氣后傷脾氣，當(dāng)微波過(guò)度暴露時(shí)，最終傷及腎氣、腎陽(yáng)[5]。金匱腎氣丸可以治療微波輻射性生精功能障礙[6]，還能提高糖尿病導(dǎo)致的睪酮水平及性功能低下[7]，但對(duì)微波輻射性睪酮水平降低及性功能障礙的療效及作用機(jī)理尚缺明確結(jié)論。本研究從微波輻射對(duì)睪丸損傷入手，研究微波對(duì)雄性小鼠性腺功能的影響，并應(yīng)用補(bǔ)腎代表方金匱腎氣丸進(jìn)行治療，研究其療效及治療機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8周齡健康雄性BALB/C小鼠30只，體質(zhì)量20～30 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2008-0002。小鼠在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)1周，適應(yīng)期間照明采用12 h明/暗周期(早7:00-晚7:00),自由飲水進(jìn)食，二級(jí)喂養(yǎng)。

1.2 藥物、試劑及主要儀器 金匱腎氣丸：北京同仁堂，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20055685，批號(hào)：16033212。睪酮(T)、雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)試劑盒：上海朗頓公司。KJ-6200B型微波治療儀：徐州市萬(wàn)諾醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)；HI-1501型微波泄露檢測(cè)儀：美國(guó)ETS-Lindgren生產(chǎn)；電子天平AR1140：梅特勒-托利多儀器上海有限公司制造；共聚焦顯微鏡：日本Nikon；YTD-2002系列醫(yī)學(xué)影像工作站：徐州市永泰電子科技有限責(zé)任公司；PT-MR 1600E組織粉碎機(jī)：KINEMATICA AO POLYTRON,Switzerland,。

1.3 模型制備 本實(shí)驗(yàn)采用畢煥洲等[8]研究的造模方法：即將小鼠分別暴露于頻率為2 450 MHz連續(xù)微波，功率密度為40 mW/cm2，輻射18 d，每天輻1 h。

1.4 分組及處理 雄性BALB/C小鼠30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，不造模，但為保持相同實(shí)驗(yàn)條件置于微波燈下不輻射18 d，喂飼0.9%氯化鈉溶液0.1 mL/d；輻射組10只，微波輻射造模后，喂飼0.9%氯化鈉溶液0.1 mL/d；金匱腎氣丸組10只，微波輻射造模后，金匱腎氣丸0.2 g/(kg·d)(即成人臨床等效劑量)0.1 mL灌胃；連續(xù)灌胃18 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 小鼠性行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在隔音、恒溫的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。將小鼠依次放入鼠籠中適應(yīng)5 min，隨后以1∶1的雌雄比投入同批飼養(yǎng)的健康雌性小鼠，觀察60 min內(nèi)以下指標(biāo)變化：①撲捉潛伏期(capture incubation period，CIP)：自雌鼠投入開(kāi)始計(jì)時(shí)，至雄鼠第一次撲捉雌鼠的時(shí)間。②撲捉次數(shù)(capture times，CT)：自雌鼠投入60 min內(nèi)，雄鼠撲捉雌鼠或爬背或舔陰動(dòng)作次數(shù)。

1.5.2 睪丸組織病理變化觀察 取小鼠另一側(cè)睪丸放入鮑溫氏液中固定24 h，石蠟包埋，將睪丸切成厚約4μm的連續(xù)石蠟切片，HE染色后光鏡觀察，判斷睪丸微環(huán)境的形態(tài)與結(jié)構(gòu)的改變，即管周肌樣細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，生精小管形態(tài)及結(jié)構(gòu)，生精小管界膜的完整性，支持細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，支持細(xì)胞間的鏈接狀態(tài)，間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)等等。

1.5.3 性激素檢測(cè) 各組小鼠眼部取血，進(jìn)行血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)含量檢測(cè)。取小鼠一側(cè)睪丸，粉碎勻漿，并將勻漿分成兩份，取一份進(jìn)行睪酮(T)、雌二醇(E2)測(cè)定。

1.5.4 睪丸組織炎性因子檢測(cè) 取小鼠睪丸組織勻漿的另一份，ELISA法進(jìn)行白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 微波輻射對(duì)小鼠性行為的影響及金匱腎氣丸的干預(yù)效果 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠性行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 微波輻射對(duì)小鼠睪丸組織學(xué)變化的影響及金匱腎氣丸的干預(yù)效果 微波輻射后，睪丸管周肌樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常；曲細(xì)精管上皮排列疏松，曲細(xì)精管界膜不完整，甚至曲細(xì)精管管腔斷裂，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白水腫液和脫落細(xì)胞；支持細(xì)胞變性、壞死脫落，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，睪丸微環(huán)境損傷明顯；各類生精細(xì)胞排列不整齊，層次不清楚，精母細(xì)胞、精子細(xì)胞變性、壞死脫落，精細(xì)胞數(shù)目明顯減少，甚則曲細(xì)精管內(nèi)無(wú)精子細(xì)胞存在。金匱腎氣丸組小鼠管周肌樣細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，曲細(xì)精管界膜完整平坦，曲細(xì)精管內(nèi)可見(jiàn)成熟精子，各類生精細(xì)胞排列整齊，層次清楚。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠睪丸組織變化的光鏡觀察(HE，×200)

2.3 微波輻射對(duì)小鼠性激素的影響及金匱腎氣丸的干預(yù)效果 見(jiàn)表2～表3。

表2 各組小鼠血清性激素水平測(cè)定結(jié)果比較

表3 各組小鼠睪丸組織性激素水平測(cè)定結(jié)果比較

2.4 微波輻射對(duì)小鼠睪丸炎性損傷的作用及金匱腎氣丸的干預(yù)效果 見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠睪丸組織IL-1β、IL-6含量比較

3 討論

前期研究表明，微波輻射可以損傷睪丸而影響生精，可使精子總活率(PR+NP)、前向運(yùn)動(dòng)精子活率(PR)及睪體比顯著降低，精子畸形率增高，金匱腎氣丸干預(yù)后，這些損傷得到了恢復(fù)[8]。睪丸易被微波損傷，微波輻射可直接損傷睪丸中的生殖細(xì)胞，但也會(huì)損傷生殖細(xì)胞之外的睪丸微環(huán)境，而改變的睪丸微環(huán)境可使生殖細(xì)胞受到二次損傷，包括微波導(dǎo)致的炎性損傷和性激素環(huán)境的改變。

在成年動(dòng)物睪丸組織中，精原干細(xì)胞及各級(jí)雄性生殖細(xì)胞位于由支持細(xì)胞(sertoli cells)組成的龕境里，其外圍由基底膜包繞，共同組成了生精小管。生精小管外圍環(huán)繞著管周肌細(xì)胞(myoid cells)、間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)、巨噬細(xì)胞、血管等間質(zhì)組織。這些體細(xì)胞及其合成分泌的各種細(xì)胞因子共同構(gòu)成了精子發(fā)生的微環(huán)境，即睪丸微環(huán)境(microenvironment, niche)[9]。睪丸組織的微波損傷，也意味著睪丸微環(huán)境有所改變。睪丸微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞受損后，睪酮的分泌會(huì)受到影響，降低的睪酮可影響生精過(guò)程，也可以導(dǎo)致性功能障礙[3-4]。

本研究表明，微波輻射后，睪丸管周肌樣細(xì)胞、支持細(xì)胞變性、各類生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞都出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)異常，金匱腎氣丸干預(yù)后，各類生精細(xì)胞恢復(fù)正常。微波輻射后小鼠睪丸組織中的IL-6顯著升高，IL-1β沒(méi)有明顯改變，但服用金匱腎氣丸后，睪丸組織中的IL-6及IL-1β皆顯著降低。微波輻射后小鼠睪丸組織中的睪酮水平?jīng)]有明顯改變，但小鼠血中T水平顯著降低；應(yīng)用金匱腎氣丸后，睪丸組織及血中睪酮皆明顯增高，與正常小鼠無(wú)顯著差別，提示恢復(fù)至正常水平。微波輻射后，血LH、FSH、PRL水平?jīng)]有明顯改變，但金匱腎氣丸干預(yù)后，血LH及PRL水平明顯增高，血FSH水平?jīng)]有明顯改變。

上述結(jié)果表明，微波輻射可以導(dǎo)致睪丸組織出現(xiàn)炎性改變，表現(xiàn)為IL-6等炎性因子的增高及睪丸微環(huán)境損傷。間質(zhì)細(xì)胞損傷可使血中T水平顯著降低，既可導(dǎo)致生育障礙，又可導(dǎo)致性功能障礙。金匱腎氣丸可以降低睪丸組織中的IL-6和IL-1β水平，消除微波導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，為生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)良好生存環(huán)境。金匱腎氣丸治療后血LH水平增高。LH又稱為間質(zhì)細(xì)胞刺激素，具有刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生T的作用，因此提高了血中T水平。表明其另一個(gè)作用機(jī)理是調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-睪丸性腺軸，促進(jìn)血LH水平，而非直接補(bǔ)充T。表明金匱腎氣丸即可以通過(guò)修復(fù)微波輻射損傷睪丸微環(huán)境保護(hù)間質(zhì)細(xì)胞以維持T正常分泌，又可以通過(guò)提高LH水平促進(jìn)T分泌，從而治療輻射性雄小鼠性腺功能減退。PRL有垂體分泌，金匱腎氣丸可使PRL水平顯著升高，表明藥物作用到垂體，但其具體的作用機(jī)理，有待于進(jìn)一步研究。