張永曉，劉珊，陳園園，王冬梅

（衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院血液內科，衡水053000）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是由于骨髓造血干細胞和造血祖細胞異常引起的克隆性造血干細胞疾病，其特征是血細胞減少，血液量不足以及造血功能衰竭[1]。近30%的MDS患者將最終發(fā)展到急性髓系白血病[2]?；熀透杉毎浦彩桥R床MDS治療的主要策略，然而由于化療耐藥、干細胞移植高成本和高風險等原因，MDS臨床治療效果有限[3,4]。因此迫切需要尋找高效且治療成本較低的MDS藥物。達那唑是人工合成的雄激素17a-乙炔睪丸酮的衍生物，具有輕度雄激素樣作用，臨床上達那唑主要用于治療子宮內膜異位癥和乳腺發(fā)育不良[5,6]。血液學研究[7]發(fā)現，達那唑具有類糖皮質激素的免疫抑制作用，可用于治療免疫性血小板減少性紫癜和自身免疫性溶血性貧血。有研究[8]曾報道了達那唑在骨髓增生性腫瘤和MDS等血液腫瘤性增生中的作用，然而其具體機制并不清楚[8]。

本研究中，我們主要通過MTT法研究了達那唑對MDS細胞SKM-1細胞活力的影響，并通過流式細胞實驗研究了達那唑對SKM-1細胞凋亡和細胞周期的影響，最后通過蛋白免疫印跡實驗研究了達那唑處理后腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）信號通路中細胞凋亡相關蛋白的表達情況。

材料和方法

1 細胞株和主要試劑

MDS細胞系SKM-1細胞購自ATCC（American type culture collection）；達那唑購自上海研生實業(yè)有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；DR5、caspase-8、Cleaved caspase-8、Cleaved PARP1、PARP1小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz；TUNEL染色試劑盒（一步法，綠色熒光）、GAPDH小鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購自上海碧云天生物科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen；MTT試劑購自美國Sigma。

2 細胞培養(yǎng)

SKM-1細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。

3 細胞活力檢測

取對數期SKM-1細胞接種于96孔板，分別加入0、10、20和40μmol/L達那唑，培養(yǎng)24、48或72h后，加入MTT溶液，室溫孵育4 h后，加入DMSO。待結晶完全溶解后，用酶標儀讀取各孔在450nm波長處的光密度（OD）值，代表細胞活力。

4 流式細胞周期檢測

取對數期SKM-1細胞接種于6孔板中，37℃孵育48h，培養(yǎng)基含0、10、20和40μmol/L達那唑。48 h后收集細胞并用70%冷乙醇在4℃條件下固定24h。隨后在含有100mmol/L RNase A和400mmol/L PI的PBS緩沖液中懸浮細胞，通過流式細胞儀分析細胞周期，FlowJo軟件統(tǒng)計。

5 TUNEL染色

SKM-1細胞接種于6孔板中，用0、10、20和40μmol/L達那唑處理SKM-1細胞48h后，PBS漂洗1次，晾干。用4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS漂洗2次，用0.5% Triton X-100透化細胞5min，PBS漂洗2次。按試劑盒說明書方法配制TUNEL檢測液，每孔加入100μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育45min；用DAPI染核5min，PBS洗2次，每次洗3min，抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡下觀察，并對TUNEL陽性細胞計數。TUNEL陽性細胞比例=TUNEL陽性細胞數/DAPI染核數×100%。

6 細胞凋亡流式細胞術檢測

用0、10、20和40μmol/L達那唑處理SKM-1細胞48h后，PBS洗3次后重懸于Annexin V結合緩沖液。加入Annexin V-FITC避光孵育15min。孵育結束立即加入PI染色10min，隨后在LSRII流式細胞儀中分析，FlowJo軟件統(tǒng)計流式細胞數據。

7 蛋白質免疫印跡

細胞以RIPA裂解后，BCA法統(tǒng)一定量。SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，隨后將蛋白質轉移至甲醇預活化的PVDF膜。轉移結束加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1h，室溫孵育一抗（anti-GAPDH 1:5000，anti-cleaved caspase-8 1:500、anti-caspase-8 1:3000, anti-DR5 1:1000, anti-cleaved PARP1 1:1000,anti-PARP1 1:2000）2h后4 °C過夜。第2d TBST洗膜后室溫孵育HRP標記的抗羊或抗鼠二抗1h，ECL化學發(fā)光顯影。膠片掃描后，Quantity One軟件分析條帶光密度（OD）值，目的蛋白相對水平=目的蛋白的OD值/GAPDH的OD值×100%。

8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數±標準誤表示，多組數據的均數之間兩兩比較采用單因素方差分析后Bonfferoni檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 達那唑抑制SKM-1細胞活力

MTT實驗結果顯示，與0μmol/L組比較，用達那唑分別處理24、48或72h后，SKM-1細胞活力均降低，達那唑濃度越高，細胞活力越低（圖1）。

圖1 達那唑對SKM-1細胞活性的影響。與0μmol/L組比較：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig.1 Effect of danazol on the cell viability of SKM-1 cells.*0.01＜P＜0.05,**0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=3

2 達那唑阻滯SKM-1細胞的細胞周期

細胞周期分析實驗結果（圖2）顯示，隨著達那唑濃度逐漸升高，SKM-1細胞處在S期的細胞比率逐漸降低，G0/G1和G2/M期的細胞比率均逐漸升高，細胞周期阻滯于G0/G1和G2/M期，表明達那唑濃度依賴性抑制SKM-1細胞的細胞周期。

3 達那唑促進SKM-1細胞凋亡

TUNEL染色顯示，隨著達那唑濃度逐漸升高，SKM-1細胞的TUNEL陽性細胞比例也逐漸升高（圖3）。Annexin V-FITC/PI法流式細胞術分析顯示，隨著達那唑濃度逐漸升高，SKM-1細胞的凋亡比例逐漸升高（圖4）。以上結果說明，達那唑濃度依賴性促進SKM-1細胞的凋亡。

圖2 . 達那唑對SKM-1細胞的細胞周期的影響。A，細胞周期的代表性流式細胞術分析結果；B，各細胞周期中細胞百分比的統(tǒng)計分析；與0μmol/L 組比較：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig. 2 Effect of danazol on the cell cycle of SKM-1 cells. A, representative flow cytometry analysis results of cell cycle; B, statistical analysis of the percentage of cells in each cell cycle; *0.01＜P ＜0.05,**0.001＜P ＜0.01, ***P ＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=4

4 達那唑上調 DR5、cleaved PARP1和 cleaved caspase-8水平

Western blot檢測顯示，隨著達那唑濃度逐漸升高，SKM-1細胞中DR5水平、cleaved PARP1/PARP1和cleaved caspase-8/caspase-8比率也逐漸增加（圖5），說明達那唑濃度依賴性上調SKM-1細胞中DR5、cleaved PARP1和cleaved caspase-8水平。

討 論

MDS是骨髓造血干細胞異常增生疾病，其具有復發(fā)率高和預后差的特點，且其臨床治療手段有限[1,4]。本研究發(fā)現達那唑可顯著抑制MDS細胞系SKM-1細胞活性并提高細胞凋亡率，同時可顯著升高TRAIL信號通路中細胞凋亡相關蛋白表達。

達那唑為合成17α-乙炔睪酮衍生物，為弱雄激素。達那唑可直接抑制卵巢甾體激素生成，使體內雌激素水平下降，臨床主要用于治療子宮內膜異位癥[5,6]?，F在的研究發(fā)現達那唑可增強體液免疫，這可能與達那唑具有類糖皮質激素的免疫抑制作用有關[9]。達那唑可用于治療不適用于干細胞抑制的MDS患者[10]，然而其具體機制并不清楚。本研究結果顯示，達那唑可呈梯度依賴性地抑制SKM-1細胞活力。細胞增殖依賴于細胞周期運行，阻滯細胞周期運行能抑制細胞增殖。因此，本研究進一步采用流式細胞實驗檢測了達那唑對SKM-1細胞的影響，結果顯示，達那唑可顯著降低SKM-1細胞S期比率，并使得細胞阻滯于G0/G1和G2/M期，這提示達那唑抑制SKM-1細胞活性的部分原因是由于其阻滯細胞周期。

圖3 達那唑促進SKM-1細胞凋亡的TUNEL染色檢測。A，代表性的TUNEL染色結果（比例尺，100μm）；B，TUNEL陽性細胞比例統(tǒng)計分析；與 0μmol/L 組比較：**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=3Fig. 3 TUNEL staining of the danazol promoting apoptosis in SKM-1 cells. A, representative TUNEL staining results (scale bar, 100μm); B, statistical analysis of the proportion of TUNEL staining positive cells; **0.001＜P ＜0.01, ***P ＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=3

在達那唑治療子宮內膜異位癥模型的研究中，達那唑可促進子宮異位內膜細胞凋亡[11]。因此本實驗考慮，達那唑對MDS細胞活性的抑制作用是否與其促進細胞凋亡相關。另外，MDS細胞凋亡增多也是MDS治療效果的最終體現方式之一。本研究實驗結果顯示，達那唑可顯著增高SKM-1細胞的凋亡。細胞凋亡主要通過細胞內（內源性）和細胞外（外源性）兩條通路觸發(fā)。外源性途徑是通過腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 或TRAIL等細胞外分子與死亡配體結合而觸發(fā)，進一步導致死亡誘導信號復合物 (death-inducing signal complex, DISC) 形成并激活caspase[12-14]。Li X等[15]報道TRAIL可顯著增強MDS細胞凋亡，說明TRAIL信號通路在抑制MDS中具有重要作用。目前已鑒定的TRAIL受體有5種，分別為R1、R2、H3、R4以及OPG。TRAIL與其受體結合后，可直接活化PARP和caspase-8引起細胞凋亡[16]。在本研究中，Western blot實驗結果顯示達那唑可使Cleaved Caspase 8表達升高，并且可引起caspase切割底物Cleaved PARP表達升高，提示達那唑可通過激活TRAIL通路引起細胞凋亡。

綜上，達那唑可顯著抑制MDS細胞活性并促進其凋亡，其機制可能與激活TRAIL信號通路相關。本研究結果為達那唑用于治療MDS提供了新的理論依據。

圖4 達那唑促進SKM-1細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI法流式細胞術檢測。A，代表性的流式細胞術檢測結果；B，細胞凋亡率的統(tǒng)計結果；與 0μmol/L 組比較：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig.4 Flow cytometry analysis of the danazol promoting apoptosis in SKM-1 cells. A, representative results of flow cytometry analysis. B, statistical analysis of apoptosis rate. *0.01＜P＜0.05, **0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group; n=4

圖5 達那唑對SKM-1細胞中TRAIL信號通路相關蛋白影響的Western blot檢測。A，DR5、cleaved PARP、PARP、cleaved caspase-8和caspase-8水平的代表性Western blot檢測；B-D，DR5/GAPDH（B）, cleaved PARP1/PARP1（C）和cleaved caspase 8/caspase 8（D）水平的統(tǒng)計學分析。與 0μmol/L 組比較：*0.01＜P＜0.05，**0.001＜P＜0.01，***P＜0.001；n=4Fig. 5 Western blot detection for the effect of danazol on the levels of TRAIL signaling pathway-related proteins in SKM-1 cells. A, representative results of the levels of DR5, cleaved PARP, PARP, cleaved caspase-8 and caspase-8 detected by Western blot; B-D: statistical analysis of DR5/GAPDH(B), cleaved PARP1/PARP1(C) and cleaved caspase 8/caspase 8(D). *0.01＜P＜0.05, **0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001, compared with the 0μmol/L group;n=4