何志昂 梁彩嬌 姜維

深圳市達(dá)科為生物工程有限公司 廣東 深圳 518000

引言

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法為化學(xué)聚合法?；瘜W(xué)聚合以過(guò)硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過(guò)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠。

研發(fā)一款蛋白電泳彩色凝膠試劑盒（BioSci? NewFlash Protein AnyKD Color PAGE Kit），需要滿足低丙烯酰胺產(chǎn)品，該產(chǎn)品使用了最新的凝膠技術(shù)降低丙烯酰胺濃度，提高凝膠速度。該凝膠試劑盒操作簡(jiǎn)便，配膠快速安全，無(wú)TEMED試劑，無(wú)特殊氣味，且提供彩色染料染色濃縮膠.彩色上層膠，易于上樣。蛋白膠凝固快，25 min即可完成整個(gè)制膠過(guò)程?？梢愿唠妷嚎焖匐娪?，300 V恒壓25 min左右即可完成電泳，也可進(jìn)行常壓電泳。適用于(10 ～ 250) kDa蛋白的分離鑒定，無(wú)須根據(jù)蛋白大小調(diào)整分離膠濃度。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)

彩色蛋白膠分別與無(wú)色蛋白膠進(jìn)行蛋白電泳測(cè)試

1.2 材料

蛋白mark（Dakewe Cat.No.8011021，8011031），NK細(xì)胞總蛋白（Dakewe 提?。?，電泳緩沖液（Dakewe Cat.No.8015021），蛋白上樣緩沖液（Dakewe Cat.No.8015011），蛋白染色液（Dakewe Cat.No.8019011），蛋白電泳儀（北京六一儀器 DYY-2C）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)組，分別為實(shí)驗(yàn)組1（紅色凝膠），實(shí)驗(yàn)組2（黃色凝膠），實(shí)驗(yàn)組3（綠色凝膠），實(shí)驗(yàn)組4（紫色凝膠），對(duì)照組（無(wú)色凝膠）。加入等量的Mark與總蛋白樣品，蛋白染色脫色相同時(shí)間。

1.3.2 制膠。分離膠A液和B液1∶1混勻，配膠可以使用15mL或50mL離心管配制。濃縮膠A液和B液1∶1混勻，然后加入濃縮膠體積0.4%～0.7%的濃縮膠染液（建議3mL濃縮膠加30ul濃縮膠染液，加入對(duì)應(yīng)顏色染料于濃縮膠的即為對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組不加染料的即為對(duì)照組）。

向上述分離膠溶液中加入10% APS溶液（5mL加50μL），混勻后灌入模具中，分離膠溶液加至距前玻璃板頂端1.5cm或距梳齒約0.5cm，迅速小心加入水、無(wú)水乙醇或異丙醇覆蓋分離膠。待分離膠凝固（3 ～ 10 min）后，倒掉覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠頂部數(shù)次以去除未聚合凝膠，排除頂部液體、用濾紙吸走殘留的去離子水。在上述濃縮膠溶液中加入10% APS溶液（2mL加20μL的10% APS溶液），混勻后灌入分離膠，將梳子插入凝膠內(nèi)，靜置15～20 min，等待凝膠聚合。

1.3.3 上樣電泳。凝膠聚合后拔出梳子、上樣。Marker使用BioSci? ColorBand Prestained Protein Marker（Cat.No.8011011& 8011021 & 8011031），上樣緩沖液使用BioSci? SuperDrop SDS-PAGE Protein Loading Buffer 5×（Cat.No.8015011）。各組上樣相同量蛋白Mrak與總蛋白，在電泳緩沖液中實(shí)現(xiàn)快速電泳，電壓最高設(shè)置為300V，25min左右完成電泳，電流最大不要超過(guò)140mA，如果電流過(guò)大產(chǎn)熱多，可降低電壓。電泳緩沖液使用BioSci? Tris Glycine SDS Running Buffer (10×)（Cat.No.8015021）。

1.3.4 蛋白染色洗脫。電泳后，各組的蛋白凝膠放置在干凈的容器中，加入300～400mL純水搖晃清洗5分鐘，重復(fù)3次。棄去純水，加入適當(dāng)體積（覆蓋凝膠為宜）的SpectBlue染色液（Cat.No.8019011）。置于搖床上染色15～30min。染色結(jié)束后，棄去染色液，加入純水洗滌去除殘留染色液，即可觀察結(jié)果。加入200mL純水進(jìn)行脫色，可每隔20min更換純水進(jìn)行漂洗，重復(fù)3～4次即可得到極低背景的凝膠[1]。

1.3.5 觀察拍照。觀察各組蛋白凝膠的條帶清晰度，染料是否遷移等，并拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 各組電泳上樣前結(jié)果如下圖

圖1中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無(wú)色蛋白凝膠制膠后的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷，濃縮膠與分離膠界限清晰，無(wú)色蛋白凝膠的濃縮膠與分離膠無(wú)明顯界限。

圖1 各組電泳上樣前結(jié)果圖

2.2 各組電泳上樣中結(jié)果

圖2中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無(wú)色蛋白凝膠上樣中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷，濃縮膠的梳孔在電泳緩沖液中清晰可見(jiàn)上樣非常方便，無(wú)色蛋白凝膠的梳孔濃縮膠在電泳緩沖液中非常模糊難以分辨。

圖2 各組電泳上樣中結(jié)果圖

2.3 各組電泳中的結(jié)果如下圖

圖3中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無(wú)色蛋白凝膠電泳中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷未褪色也為發(fā)生遷移擴(kuò)散，電泳條帶與無(wú)色蛋白凝膠無(wú)差別。

圖3 各組電泳中的結(jié)果圖

2.4 各組電泳染色后的結(jié)果

圖4中abcde分別為紅、黃、綠、紫、無(wú)色蛋白凝膠電泳中的圖片，可以看出有色濃縮膠顏色鮮艷未褪色也為發(fā)生遷移擴(kuò)散，電泳條帶與無(wú)色蛋白凝膠無(wú)差別[2]。

圖4 各組電泳染色后的結(jié)果圖

3 討論

市面上的SDS-PAGE蛋白凝膠常用的濃縮膠是無(wú)色透明，在無(wú)色的電泳緩沖液中，很難看清蛋白上樣梳孔，我們研發(fā)的彩色SDS-PAGE蛋白凝膠，濃縮膠可以選擇紅、黃、綠、紫四種顏色。在無(wú)色的電泳緩沖液中，可以清晰看清蛋白上樣梳孔，極大地提高了上樣的辨識(shí)性，減少了蛋白上樣的錯(cuò)誤率。此外所用的濃縮膠彩色染料是惰性染料，長(zhǎng)期保存也不會(huì)發(fā)生顏色改變。染料鮮艷且可以非常均勻的染色濃縮膠，在電泳的過(guò)程中染料顏色沒(méi)有發(fā)生遷移也沒(méi)有顏色變淡，也沒(méi)有與Mark或蛋白結(jié)合而影響其電泳遷移。濃縮膠染料可以清晰地分界濃縮膠與分離膠方便做蛋白Westen時(shí)準(zhǔn)確的分離切除濃縮膠。也可以根據(jù)不同的樣品選擇不同的顏色的蛋白凝膠，從顏色上更加方便的區(qū)分不同樣本的電泳的結(jié)果。