金 紅，龐麗瑩，李華洋，徐明鑫，閆海潤，李榮輝

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院1檢驗科，3質(zhì)控辦，黑龍江 牡丹江 157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位，新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬，多數(shù)確診時已處于中晚期［1］。在我國，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上各趨勢［2-4］。一般認(rèn)為結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展是因為一系列遺傳性改變累積造成的，其中包括癌基因、抑癌基因和DNA 修復(fù)基因的改變［5-7］。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)癌癥早期出現(xiàn)特定基因的表觀遺傳突變。特定基因啟動子區(qū)域中CpG島的異常甲基化與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)，尤其在結(jié)直腸癌致癌的早期階段［8-10］，整聯(lián)蛋白是跨膜糖蛋白的超家族，整聯(lián)蛋白alpha4（ITGA4）就是整聯(lián)蛋白家族的一員，已被證明在許多不同的人類腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中過表達，并被認(rèn)為與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［11］。SFRP2 基因?qū)儆谝活愋碌哪[瘤抑制基因SFRP家族，是一種糖蛋白，可作為致瘤性Wnt 途徑的抑制性調(diào)節(jié)劑。結(jié)直腸癌患者的血漿中檢測出ITGA4和SFRP2基因異常甲基化，血漿中ITGA4和SFRP2基因異常甲基化被認(rèn)為是一種敏感的實驗室檢測指標(biāo)，可以檢測出36.84%、54.39%的結(jié)直腸癌［12］。ITGA4 和SFRP2基因表達失活是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，而ITGA4和SFRP2基因甲基化是導(dǎo)致失活的重要原因［13-14］，因此研究ITGA4和SFRP2基因甲基化對于結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后判斷有重要作用。

對于結(jié)直腸腫瘤，相較于血漿來講，糞便中的DNA穩(wěn)定性更好，而且直接來源于脫落的腫瘤細(xì)胞，陽性率會更高，易檢測，糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化的檢測在結(jié)直腸癌中的診斷價值國內(nèi)外鮮有報道［15］，尤其糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌中的診斷價值及與結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的深入研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究旨在臨床糞便標(biāo)本中檢測ITGA4和SFRP2基因甲基化表達情況并分析聯(lián)合檢測的價值，及其與結(jié)直腸癌分期、分型和臨床預(yù)后的相關(guān)性，上述研究可以為結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)測預(yù)后提供具有應(yīng)用價值的甲基化的新分子標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的生物治療提供新策略。

1 資料和方法

1.1 材料

收集2017年1月～2018年10月在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院進行內(nèi)鏡檢查的85例結(jié)直腸癌患者。其中男50例，女35例，年齡49.47±15.26（32～75）歲。以病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，入選患者均記錄性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、結(jié)直腸癌TNM分期和病理類型等。以65例結(jié)直腸腺瘤患者和40例健康志愿者作為對照組。結(jié)直腸癌的病理組織類型：（1）腺癌；（2）腺鱗癌；（3）未分化癌；（4）鱗狀細(xì)胞癌；（5）小細(xì)胞癌。結(jié)直腸癌的TNM分期按美國癌癥聯(lián)合委員會結(jié)直腸癌TNM分期進行判斷。所有實驗通過倫理委員會審查。

1.1 結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)（1）內(nèi)鏡檢查并經(jīng)病理學(xué)明確診斷的；（2）采集標(biāo)本前所有患者未經(jīng)過新輔助放化療和其它免疫治療；（3）所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

結(jié)直腸癌排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因心腦、肝腎功能異?；蚱渌蛭唇邮苁中g(shù)治療的患者；（2）術(shù)前合并全身感染、術(shù)后病理未證實為結(jié)直腸癌的患者；（3）圍手術(shù)期死于并發(fā)癥的患者。

1.3 標(biāo)本采集

所有標(biāo)本均于確診后術(shù)前采集，健康對照組隨機采集。樣本為糞便，取樣量在1.5～10 g。將含有樣本保存液的糞便樣本振蕩混勻，并冷凍儲存在-80 ℃的環(huán)境中備用，測定時室溫下解凍，避免標(biāo)本反復(fù)凍融。

1.4 糞便基因組DNA提取、鑒定及修飾純化

分別采用QIA amp DNA stool Mini Kit提取糞便樣本中全基因組DNA，按說明書進行，分光光度計檢測DNA濃度，要求吸光度比值A(chǔ)260/280在1.8～1.9，DNA量不少于250～300 mg，以符合甲基化修飾要求。采用EpiTect Bisulfite試劑盒對各樣本基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾及純化，按說明書進行操作。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化水平

所有引物由上海生工公司合成。根據(jù)文獻［12,24］設(shè)計出針對亞硫酸鹽修飾后的ITGA4和SFRP2基因甲基化和非甲基化引物序列，具體引物序列如下：ITGA4甲基化引物：上游引物：5'GCGGTCCCAAAAGGGTC AGTTATTACGTTCGGGATTTTATTTAGC 3'，下游引物：5'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGAAATACGA CGATTAACCAACG 3'；擴 增 片 段 長 度 為300 bp，SFRP2 甲基化引物：上游引物：5' GGGTCGGAGTT TTTCGGAGTTGCGC 3'，下游引物：5' CCGCTCTCT TCGCTAAATACGACTCG 3'；擴增片段長度為138 bp。

ITGA4 非甲基化引物：上游引物：5'GCGGT CCCAAAAGGGTCAGTATTATGTTTGGGATTTTAT TTAGTG 3，下游引物：5'GCGGTCCCAAAAGGGTC AGTCAAAATACAACAATTAACCAACAAA；擴增片段長度為300 bp。

SFRP2 非甲基化：上游引物：5'TTTTGGGTTGG AGTTTTTTGGAGTTGTGT 3，AACCCACTCTCTT CACTAAATACAACTCA；擴增片段長度為145 bp。PCR 反應(yīng)如下：預(yù)變性95 ℃5 min，循環(huán)（40 個）變性95 ℃30 s，退火（ITGA4甲基化和非甲基化61 ℃72 s，SFRP2甲基化61 ℃，SFRP2非甲基化50 ℃，延伸72 ℃，60 s，延伸72 ℃10 min。采用SYBR GreenⅠ熒光進行標(biāo)記，采用實時熒光定量PCR儀進行檢測，同時進行凝膠電泳定性檢測。

凝膠電泳結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲基化陽性結(jié)果：甲基化特異性引物擴增出相應(yīng)長度的片段，非甲基化特異性引物未擴增出相應(yīng)長度的片段；（2）甲基化陰性結(jié)果：非甲基化特異性引物擴增出相應(yīng)長度的片段，甲基化特異性引物未擴增出相應(yīng)長度的片段；

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，兩組間的差異用t檢驗進行比較，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以個數(shù)和率表示，用χ2或Fisher檢驗來比較兩組間的統(tǒng)計差異。用Kaplan-Meier法繪制無復(fù)發(fā)生存時間曲線，采用Log-rank檢驗比較無復(fù)發(fā)生存率。采用COX比例風(fēng)險回歸模型對影響復(fù)發(fā)的臨床病理基本特征等因素進行單因素和多因素分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床特征比較

3個組年齡性別無明顯差別（表1）。

表1 3組臨床特征比較Tab.1 Comparison of the clinical characteristics among the 3 groups

2.2 3 組患者糞便ITGA4 和SFRP2 基因甲基化電泳結(jié)果

將3組基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾及純化后，進行凝膠電泳，ITGA4基因甲基化和非甲基化電泳結(jié)果（圖1），SFRP2基因甲基化和非甲基化電泳結(jié)果（圖2）。

圖1 ITGA4基因甲基化和非甲基化電泳結(jié)果圖Fig.1 Electrophoresis of ITGA4 gene methylation and nonmethylation.Lanes 1,2:Healthy control group;Lanes 3,4:Colorectal adenoma group;Lanes 5,6:Colorectal cancer group;Lanes 1,3 and 5:Methylation results of ITGA4 gene;Lanes 2,4 and 6:Non-methylation results of ITGA4 gene.

圖2 SFRP2基因甲基化和非甲基化電泳結(jié)果圖Fig.2 Electrophoresis of SFRP2 gene methylation and nonmethylation.Lanes 1,2:Healthy control group;Lanes 3,4:Colorectal adenoma group;Lanes 5,6:Colorectal cancer group;Lanes 1,3 and 5:Methylation results of SFRP2 gene;Lanes 2,4 and 6:Non-methylation results of SFRP2 gene.

2.3 3組患者糞便ITGA4和SFRP2基因單獨和聯(lián)合檢測的陽性檢出率比較

糞便ITGA4和SFRP2基因啟動子甲基化在結(jié)直腸癌中的陽性檢出率分別為48.2%和62.4%，聯(lián)合檢測的陽性檢出率81.2%；在結(jié)直腸腺瘤中的陽性檢出率分別為23.1%和43.1%，聯(lián)合檢測的陽性檢出率69.2%。結(jié)直腸癌組ITGA4和SFRP2基因啟動子甲基化陽性檢出率明顯高于結(jié)直腸腺瘤組（P<0.001，P=0.001）和健康對照組（P<0.001，P<0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 3組患者糞便ITGA4和SFRP2基因陽性檢出率比較Tab.2 Comparison of positive rates of ITGA4 and SFRP2 gene methylation in stool samples of the 3 groups(n,%)

2.4 結(jié)直腸癌組ITGA4和SFRP2基因甲基化與臨床病理特征關(guān)系比較

收集的85例結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料如下表，85例全部是腺癌，低分化腺癌23例，中分化腺癌28例，高分化腺癌34例。統(tǒng)計了ITGA4和SFRP2基因甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，ITGA4和SFRP2基因甲基化均與腫瘤復(fù)發(fā)和病理分化程度有關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05，表3）。

表3 入選結(jié)直腸癌患者基本特征和基線資料比較Tab.3 Comparison of baseline data of patients with colorectal cancer(n)

2.5 各組糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化水平比較

閾值循環(huán)（Ct），為熒光信號強度超過設(shè)置的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值<40的基因甲基化樣品進行凝膠電泳都會出現(xiàn)相應(yīng)陽性條帶，而Ct值>40的基因甲基化樣品進行凝膠電泳未出現(xiàn)相應(yīng)陽性條帶，于是我們將Ct值40作為實時熒光定量PCR的閾值，進行以Ct值水平的量化值（圖3）。并且對ITGA4和SFRP2基因甲基化Ct值分別為26和27的樣品進行了稀釋實驗，發(fā)現(xiàn)稀釋后的樣品相應(yīng)循環(huán)數(shù)增加，并做了重復(fù)結(jié)果驗證實驗。

圖3 ITGA4（A）和SFRP2（B）基因甲基化稀釋實驗擴增曲線圖Fig.3 Amplification curve of methylation dilution experiment of ITGA4(A)and SFRP2(B)genes.1:Amplification curve of the sample with Ct value of 26;2,3 and 4:Amplification curves of 10,50 and 100 times dilution,respectively.

結(jié)直腸癌患者糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化水平（以Ct值進行量化）要明顯高于良性結(jié)直腸腫瘤患者（P=0.003，P=0.005），良性結(jié)直腸腫瘤患者糞便中ITGA4 和SFRP2 基因甲基化水平要高于健康人（P=0.02，P=0.03，表4）。

表4 各組糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化表達水平比較Tab.4 Comparison of the methylation levels of ITGA4 and SFRP2 genes in stool samples of each group(Mean±SD)

2.6 ITGA4和SFRP2基因甲基化水平與結(jié)直腸癌患者無復(fù)發(fā)生存期的關(guān)系

自2017年1月開始隨訪結(jié)直腸癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)情況，最長隨訪時間為觀察到2020年12月1日結(jié)束。經(jīng)臨床、影像學(xué)經(jīng)檢查和/或病理分析等明確診斷結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)情況觀察終點為發(fā)現(xiàn)局部原位復(fù)發(fā)伴隨局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠端轉(zhuǎn)移的時間點。未復(fù)發(fā)組的最終觀察時間點為2020年12月1日。85例結(jié)直腸癌患者中，共52例復(fù)發(fā)，32例未復(fù)發(fā)，1例由于更換聯(lián)絡(luò)方式和未到本醫(yī)院復(fù)查而失訪。復(fù)發(fā)的中位時間為7.7月，最長的復(fù)發(fā)時間是22月，最短的復(fù)發(fā)時間是1月。

采用Kaplan-Meier法分別繪制兩組患者的無復(fù)發(fā)生存曲線，采用Log-rank檢驗進行組間生存率的比較。ITGA4甲基化陽性患者無復(fù)發(fā)生存率明顯低于ITGA4甲基化陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.523，P=0.002）；SFRP2甲基化陽性患者無復(fù)發(fā)生存率明顯低于SFRP2甲基化陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.894，P=0.007，圖4）。

圖4 結(jié)直腸癌無復(fù)發(fā)生存曲線圖Fig.4 Recurrence-free survival curves of patients with colorectal cancer.A:Recurrence-free survival curves for patients positive and negative for ITGA4 methylation;B:Recurrence-free survival curves for patients positive and negative for SFRP2 methylation.

2.7 結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素和多因素分析

COX比例風(fēng)險回歸模型單因素分析結(jié)果顯示，分化程度（P=0.002）、TNM分期（P=0.02）、ITGA4甲基化（P<0.001）和SFRP2甲基化（P=0.03）與結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。

采用COX比例風(fēng)險回歸模型多因素分析影響結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的因素，ITGA4甲基化陽性引起結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險是陰性的3.586倍，SFRP2甲基化陽性引起結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險是陰性的2.978倍。糞便ITGA4甲基化(風(fēng)險率（HR）=3.586，P=0.01)、SFRP2 甲基化（HR=2.978，P=0.03）和腫瘤分化程度（HR=2.151，P=0.02）是結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素（表5）。

表5 結(jié)直腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)影響因素的單因素和多因素回歸分析Tab.5 Univariate and multivariate regression analysis of the factors affecting postoperative recurrence of colorectal cancer

3 討論

近幾年我國結(jié)直腸腫瘤新增病例逐漸增加［16］，尤其男性多見，已經(jīng)成為威脅人類健康的主要殺手。結(jié)直腸腫瘤一般采用糞便隱血實驗和結(jié)腸鏡進行篩查［17-18］，糞便隱血實驗敏感性低，結(jié)腸鏡因為前期準(zhǔn)備繁瑣，患者耐受性較差，所以應(yīng)用受限，因此尋找結(jié)直腸腫瘤患者的非侵入性的分子診斷標(biāo)志物用于篩查和診斷尤為重要。

最新研究發(fā)現(xiàn)使用分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測血液DNA中遺傳和表觀遺傳異常已被認(rèn)為是進行結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤篩查的有效的非侵入性方法［19］。血漿中DNA甲基化檢測有助于腫瘤的診斷，評估腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后，并指導(dǎo)臨床治療［20］。Liu等［21］研究發(fā)現(xiàn)，SFRP2基因在腫瘤組織中常被高度甲基化，進行COX單因素和多因素回歸分析顯示，SFRP2基因高度甲基化是結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存的獨立預(yù)后因子；Zhang等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中，血漿中檢出高甲基化的GATA4和SFRP2，與腺瘤組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，血漿中GATA4和SFRP2甲基化與腫瘤分化狀態(tài)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，血漿中GATA4和SFRP2甲基化是有價值的預(yù)測因子。通過我們對糞便DNA甲基化的研究發(fā)現(xiàn)：糞便中ITGA4基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的檢出率分別為23.1%和48.2%，健康對照組檢出率為0；糞便中SFRP2基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的檢出率分別為43.1%和62.4%，健康對照組檢出率為0。我們對兩個基因進行聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺瘤聯(lián)合檢測的檢出率69.2%，在結(jié)直腸癌中聯(lián)合檢測的檢出率81.2%，比單獨檢測要敏感，大大提高了檢出的陽性率，ITGA4和SFRP2甲基化聯(lián)合檢測具有更高的敏感性，可見，聯(lián)合檢測可能是結(jié)直腸癌診斷的較好的實驗室指標(biāo)。同時我們研究了ITGA4和SFRP2基因甲基化與結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)ITGA4和SFRP2基因甲基化均與腫瘤復(fù)發(fā)和病理分化程度有關(guān)。

我們同時利用Ct值對甲基化結(jié)果進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)Ct值越小的甲基化含量越高，ITGA4和SFRP2基因甲基化水平結(jié)直腸癌組高于腺瘤組和對照組。同時我們研究了ITGA4和SFRP2基因甲基化水平與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系，我們的研究發(fā)現(xiàn)，ITGA4和SFRP2基因甲基化陽性多為腺癌低分化，發(fā)生復(fù)發(fā)的比例高；我們還首次研究了手術(shù)前糞便中ITGA4 和SFRP2基因甲基化與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，ITGA4甲基化陽性患者無復(fù)發(fā)生存率明顯低于ITGA4甲基化陰性患者，SFRP2甲基化陽性患者無復(fù)發(fā)生存率明顯低于ITGA4甲基化陰性患者，利用COX比例風(fēng)險回歸模型多因素分析影響結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的因素，ITGA4甲基化陽性引起結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險是陰性的3.586倍，SFRP2甲基化陽性引起結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險是陰性的2.978倍，ITGA4 和SFRP2 基因甲基化均與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，ITGA4和SFRP2基因甲基化陽性的無復(fù)發(fā)生存率低，預(yù)后差，陰性的不易復(fù)發(fā)。ITGA4和SFRP2基因甲基化可以作為結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因子。為結(jié)直腸癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，可通過檢測患者術(shù)前糞便ITGA4和SFRP2基因甲基化對患者預(yù)后進行評估，對患者進行分級管理，加強術(shù)后監(jiān)測及時發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，選擇適當(dāng)?shù)闹委?，改善患者預(yù)后。

近幾年，糞便DNA甲基化在結(jié)直腸腫瘤中的價值逐漸被發(fā)現(xiàn)［22-25］，由于DNA 的甲基化變化無處不在，被認(rèn)為是結(jié)直腸瘤形成的重要致癌機制，因此糞便中甲基化DNA的分析為結(jié)直腸癌篩查提供了一個新的策略［12,26-27］，特定基因的CpG島的甲基化發(fā)生在結(jié)直腸癌的癌變過程中的腺瘤-癌序列的局灶性病變中［28-30］。在糞便DNA中使用高甲基化篩查大腸癌和腺瘤是一種早期檢測大腸腫瘤的新方法，與目前的篩查方法相比，具有低成本和接受性更高的潛力［31］。DNA甲基化檢測只需一次糞便標(biāo)本，相較于糞便隱血檢測更方便，同時DNA甲基化在糞便中的穩(wěn)定性較好，易檢測，因此糞便中ITGA4和SFRP2基因甲基化聯(lián)合檢測是一個新的對結(jié)直腸腫瘤的非侵入性篩選的潛在診斷性生物標(biāo)志物，同時ITGA4和SFRP2基因甲基化可以作為結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因子，用于評估結(jié)直腸癌術(shù)后預(yù)后情況。但是我們實驗數(shù)據(jù)仍然較少，希望在后期研究中增大臨床樣本量，對患者的隨訪時間有限，雖然目前隨訪時間內(nèi)數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是如果增加隨訪時間意義會更大。