劉姍姍，劉玉東，張容秀，路曉淼，胡 浩，胡 潔，張 凱，孫 鈺

蚌埠醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠 233004；蚌埠醫(yī)學(xué)院2組織胚胎學(xué)教研室，3衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030

齲病是牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種常見的口腔疾病。黨和國(guó)家一直高度重視人民健康，“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要中提出“加強(qiáng)口腔衛(wèi)生，12歲兒童患齲率控制在25%以內(nèi)”。根據(jù)第四次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，我國(guó)3～5歲兒童的齲病患病率分別是50.8%、63.6%及71.9%，12～15 歲青少年齲病患病率分別是38.5%、41.2%、43.3%、44.4%；而老年人齲病的患病率更是高達(dá)98.1%［1-3］。由此可見，齲病的防治十分重要。

口腔定植菌間的相互作用在齲病的發(fā)生中發(fā)揮重要角色［4-6］。在眾多的口腔定植菌中變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii）是兩種研究較多的細(xì)菌［7-8］。變異鏈球菌是重要的致齲菌，其通過代謝口腔環(huán)境中的碳源產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，導(dǎo)致牙齒脫礦，這種過程持續(xù)存在即產(chǎn)生齲病［9-10］，而格氏鏈球菌是定植于牙面的非致齲菌，其代謝產(chǎn)生的過氧化氫可有效抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生的堿性產(chǎn)物氨可平衡變異鏈球菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境，在齲病的發(fā)生中起重要的抑制作用［11-13］。同時(shí)，臨床研究數(shù)據(jù)表明，牙菌斑樣本中變異鏈球菌的檢出率與齲病呈正相關(guān)，而格氏鏈球菌的檢出率與齲病呈負(fù)相關(guān)［14-15］。因此，變異鏈球菌與格氏鏈球菌的相互競(jìng)爭(zhēng)作用結(jié)果是口腔定植菌影響齲病發(fā)生的重要因素。

變鏈素Ⅳ是變異鏈球菌產(chǎn)生的拮抗格氏鏈球菌生長(zhǎng)、推動(dòng)齲病發(fā)生的一類重要細(xì)菌素［16］。研究表明，變鏈素IV的表達(dá)受變異鏈球菌SepM蛋白的調(diào)控，以變異鏈球菌UA159標(biāo)準(zhǔn)株為參照，sepM敲除株和nlmAB（變鏈素IV編碼基因）敲除株的表型一致，均無變鏈素Ⅳ的產(chǎn)生，而sepM回補(bǔ)株的變鏈素IV表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)株（即野生株）一致［17］。SepM是由346個(gè)氨基酸殘基編碼產(chǎn)生的變異鏈球菌細(xì)胞壁錨定蛋白，主要包括跨膜區(qū)（第10～26個(gè)氨基酸殘基）、PDZ區(qū)域（第131～195個(gè)氨基酸殘基）及C末端（第233～314個(gè)氨基酸殘基）［17］。由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的感受刺激肽（CSP-21）可識(shí)別ComDE雙組份調(diào)控系統(tǒng)（ComDE系統(tǒng)），繼而激活該系統(tǒng)正調(diào)控的變鏈素IV的表達(dá)［18］?；蛲蛔兛赏ㄟ^影響基因或蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而影響相應(yīng)的表型，然而變異鏈球菌SepM的編碼基因sepM序列中是否存在影響變鏈素IV表達(dá)的突變類型尚不清楚。因此，本文應(yīng)用前期牙菌斑樣本中分離并保存的變異鏈球菌臨床株，以細(xì)菌基因組突變對(duì)細(xì)菌毒力的影響為出發(fā)點(diǎn)，初步探索細(xì)菌互作在齲病發(fā)生中的機(jī)制，為尋找齲病預(yù)測(cè)和防治的新靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 變異鏈球菌臨床株變鏈素IV形成能力的檢測(cè)

80株變異鏈球菌臨床株變鏈素IV的檢測(cè)參考我們前期的研究，即每株臨床株在腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）液體培養(yǎng)基于37℃、5%CO2環(huán)境下過夜培養(yǎng)，調(diào)A600至0.3。取10 μL菌液于BHI瓊脂板上，12 h后將等量的指示菌格氏鏈球菌（戈登鏈球菌）ATCC10558 接種于變異鏈球菌臨床株旁并繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后變異鏈球菌旁抑菌圈的大小即為該菌株的變鏈素IV形成能力［19］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 變異鏈球菌臨床株最小生成樹和進(jìn)化樹的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)室保存的80 株變異鏈球菌臨床株已采用Illumina NovaSeq6000 PE150平臺(tái)進(jìn)行了全基因組測(cè)序，繼而采用SOAPdenovo軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的組裝，測(cè)序結(jié)果已上傳NCBI［20］。根據(jù)核心基因組多位點(diǎn)序列分型美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（cgMLST）方法采用Perl5.18.2構(gòu)建這80株變異鏈球菌臨床株的最小生成樹；采用TreeBeST軟件根據(jù)最大似然法構(gòu)建這80個(gè)樣本的進(jìn)化樹，步進(jìn)參數(shù)設(shè)置為1000；采用Interactive Tree Of Life（iTOL）v5（https://itol.embl.de/）繪制進(jìn)化樹［21-23］。

1.3 變異鏈球菌臨床株sepM基因突變的分析

采用GeneMarkS 軟件（verison4.17）（http://topaz.gatech.edu/）對(duì)變異鏈球菌臨床株的最終組裝結(jié)果進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)及過濾［24］。以變異鏈球菌UA159菌株的全基因組序列（NC_004350.2）為參考，將預(yù)測(cè)得到的基因信息與該參考基因組進(jìn)行比對(duì)，將CDS 區(qū)cover≥70%并且identity≥50%的預(yù)測(cè)基因定義為已知基因［25］。將變異鏈球菌臨床株sepM基因與參考基因組sepM全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)，分析臨床株中sepM的突變類型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料的分析和比較采用pearson chi-square檢驗(yàn)（理論頻數(shù)≥5）、連續(xù)校正法[1≤理論頻數(shù)<5（單元格數(shù)≤20%）]或Fisher精確概率法（不符合前兩者的情況）；定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其分析和比較采用t檢驗(yàn)，定量資料中每組樣本量不足3的未納入統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 變異鏈球菌臨床株最小生成樹和進(jìn)化樹的構(gòu)建

80株變異鏈球菌株共有25株細(xì)菌有變鏈素IV形成能力（變鏈素IV形成組），另55株細(xì)菌缺乏變鏈素IV形成能力（無變鏈素形成組）。根據(jù)變異鏈球菌臨床株的核心基因組數(shù)據(jù)，我們構(gòu)建了這兩組菌株相應(yīng)的最小生成樹（圖1）和進(jìn)化樹（圖2）。

圖1 80株變異鏈球菌臨床株的最小生成樹Fig.1 Minimum spanning tree of the 80 clinical isolates of S.mutans.

2.2 變異鏈球菌臨床株sepM基因突變的分析

80株變異鏈球菌臨床株的基因組與參考基因組UA159比對(duì)后，均存在已知基因sepM。臨床株中sepM基因均全長(zhǎng)表達(dá)，不存在堿基的插入和缺失，并且共檢測(cè)到34個(gè)點(diǎn)突變。在這些點(diǎn)突變里，包含26個(gè)同義突變和8個(gè)錯(cuò)義突變（表1）。

表1 變異鏈球菌臨床株中sepM基因突變類型Tab.1 Mutations of sepM in 80 clinical isolates of S.mutans

2.3 sepM基因突變與變鏈素IV形成能力關(guān)系的分析

變鏈素IV形成組和無變鏈素IV形成組間差異分布的sepM臨床點(diǎn)突變共4個(gè)，其中錯(cuò)義突變和同義突變位點(diǎn)各占50%。這4 個(gè)突變位點(diǎn)（C31T、G533A、C756T、C1036T）在變鏈素IV形成組的分布頻率顯著高于無變鏈素IV形成組。這些差異分布的突變位點(diǎn)進(jìn)一步的分析結(jié)果表明，突變組變鏈素IV的形成能力也顯著高于非突變組（表2）。

表2 80株變異鏈球菌臨床株中差異分布的sepM基因突變類型與變鏈素的關(guān)系Tab.2 Association of the differentially distributed sepM mutations with mutacin IV production in the 80 clinical isolates of S.mutans

3 討論

最小生成樹主要通過菌株間等位基因的區(qū)別來了解菌株間的差異，而進(jìn)化樹是分析細(xì)菌起源的重要手段，這兩種方法已廣泛用于細(xì)菌基因組的分析［26-30］。多位點(diǎn)序列分型法（MLST）是既往用于變異鏈球菌流行病學(xué)研究的重要分型方法［31-35］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，該方法難以區(qū)分基因組相似的細(xì)菌，因此，我們構(gòu)建了優(yōu)于MLST的cgMLST［20］?；谠摲椒ㄖ械暮诵幕蚪M，并結(jié)合本研究中這些菌株的變鏈素IV的表達(dá)水平，我們構(gòu)建了這80株細(xì)菌的最小生成樹和進(jìn)化樹。本研究發(fā)現(xiàn)，變鏈素IV形成組內(nèi)部菌株之間的差異少于組間菌株之間的差異。這可能與變鏈素IV形成組組內(nèi)菌株的起源相似或相同相關(guān)。因此，我們進(jìn)一步構(gòu)建這80株細(xì)菌的進(jìn)化樹，而進(jìn)化樹的結(jié)果也與最小生成樹保持一致，即在最小生成樹中等位基因差異小的菌株在進(jìn)化樹中均起源自相同的分支。

以往研究報(bào)道，細(xì)菌基因突變可能通過改變自身毒力的表達(dá)進(jìn)而增加或降低機(jī)體的患病風(fēng)險(xiǎn)。例如，金黃色葡萄球菌WalK蛋白的223位氨基酸G突變?yōu)镈后，導(dǎo)致WalK 和下游WalR的磷酸化水平下調(diào)，從而降低了金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁厚度、自溶能力及其對(duì)萬古霉素的敏感性［36］；侵襲性肺炎鏈球菌源性腦膜炎患者中分離的肺炎鏈球菌細(xì)胞壁代謝相關(guān)蛋白PBP1b的編碼基因pbp1b的641位堿基有24%的A突變?yōu)镃，顯著高于對(duì)照組（11%）；進(jìn)一步在肺炎鏈球菌R6標(biāo)準(zhǔn)株中構(gòu)建pbp1b A641C 突變株，發(fā)現(xiàn)突變株的最小殺菌時(shí)間顯著長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)株［37］。因此，本文應(yīng)用與疾病發(fā)病狀態(tài)更接近的變異鏈球菌臨床株，在了解有變鏈素IV形成能力和無變鏈素IV形成能力的變異鏈球菌臨床株之間的差異和進(jìn)化趨勢(shì)后，進(jìn)一步探索sepM突變與變鏈素IV形成的關(guān)系。

CSP-21是變異鏈球菌產(chǎn)生的并分泌至菌體外的由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，其末端3個(gè)氨基酸可被剪切形成由18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽CSP-18，CSP-18是比CSP-21活性顯著的多肽，其進(jìn)一步與下游ComD結(jié)合，促進(jìn)ComD及其下游ComE的磷酸化，磷酸化的ComE識(shí)別并結(jié)合至變鏈素IV編碼基因nlmA和nlmB的啟動(dòng)子區(qū)，激活變鏈素IV的表達(dá)［18,38-39］。而SepM是裂解CSP-21生成CSP-18的關(guān)鍵蛋白酶［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然所有菌株均能檢測(cè)到完整的1041bp sepM序列，但是這些菌株的變鏈素IV水平卻存在區(qū)別。這也進(jìn)一步提示并初步印證變鏈素IV的表達(dá)差異可能與sepM基因存在多態(tài)性相關(guān)。sepM序列比對(duì)結(jié)果亦表明，變鏈素IV形成組和無變鏈素IV形成組間存在4個(gè)差異分布的sepM臨床突變位點(diǎn)，并且這些突變位點(diǎn)的突變組和非突變組菌株中變鏈素IV水平也存在顯著差異。這提示，sepM基因突變可能與變鏈素IV的形成相關(guān)。后期需要更多的樣本量并結(jié)合點(diǎn)突變的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證具體的有意義的位點(diǎn)在變鏈素IV形成中的作用。

綜上所述，變異鏈球菌臨床株中可能存在與變鏈素IV形成密切相關(guān)的點(diǎn)突變，這為后續(xù)針對(duì)致齲菌的毒力干預(yù)提供了理論依據(jù)，并為齲病的精準(zhǔn)預(yù)防提供了潛在的方向。