文智慧，梁煒祺，3，鐘依秀，3，孫 菲，3，張慶玲2，

1南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理科，廣東廣州 510080；3南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織最新公布數(shù)據(jù)顯示，在中國(guó)癌癥患者中，胃癌總發(fā)病率和死亡率均排名第3［1］。由于早期胃癌缺乏特異性癥狀，難以被發(fā)現(xiàn)，90%患者診斷時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期［2］。雖然手術(shù)、輔助放化療等治療方法在一定程度上能夠改善胃癌患者的生存期，但由于化療耐藥等原因胃癌患者的5年生存率僅為5%～15%［3］。尋找胃癌預(yù)后標(biāo)志物，可能為胃癌患者生存和治療提供相關(guān)指導(dǎo)。

利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析為癌癥分子機(jī)制的研究提供新的平臺(tái)和思路，其具有高通量和全方位分析的特點(diǎn)，在探討癌癥發(fā)展過(guò)程中基因表達(dá)和調(diào)控等方面的優(yōu)勢(shì)明顯［4］。本文通過(guò)GEO、Oncomine、TCGA3大數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選出胃癌組織中顯著差異表達(dá)的基因——NNMT，煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)是一種腫瘤代謝相關(guān)產(chǎn)物，通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)尼克酰胺水平及以S 腺苷蛋氨酸為甲基供體調(diào)節(jié)N-甲基化后的修飾，從而調(diào)控藥物、毒素、激素和微量元素的代謝，參與多種疾病的發(fā)生和病理生理過(guò)程［5］。研究發(fā)現(xiàn)，NNMT在腦膠質(zhì)瘤［6］，皮膚癌［7］，腸癌［8］，胰腺癌［9］，胃癌［10］等組織中異常表達(dá)。NNMT的較低表達(dá)預(yù)示了胃癌的預(yù)后更好［11］；NNMT 可作為腸癌和卵巢癌的潛在預(yù)后和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物［12-13］。但NNMT在胃癌中的作用及發(fā)揮生物功能的分子機(jī)制尚未完全闡明，為進(jìn)一步探討NNMT 在胃癌中的作用機(jī)制，本研究首先利用臨床樣本對(duì)NNMT 的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，在胃癌細(xì)胞中研究其生物學(xué)功能，并進(jìn)一步結(jié)合STRING、KMplotter、GSEA、DAVID、Cytoscape 等多種工具對(duì)NNMT 相互作用蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析和探討，為胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及診療研究提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)。以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，界定物種為人類(lèi)以及數(shù)據(jù)類(lèi)型為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后進(jìn)行篩選，共確定了20個(gè)數(shù)據(jù)集。納入標(biāo)準(zhǔn)：①每個(gè)數(shù)據(jù)集包括胃癌樣本組和對(duì)照樣本組(健康組織、相鄰的非癌組織、正常胃癌細(xì)胞系)；②每組至少包含2個(gè)樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)數(shù)據(jù)集，是其他數(shù)據(jù)集的一部分；②數(shù)據(jù)集類(lèi)型不是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；③數(shù)據(jù)集缺乏正常對(duì)照組樣本。最后選擇納入GSE19826和GSE13861基因表達(dá)譜。使用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，篩選差異表達(dá)基因的同時(shí)對(duì)NNMT進(jìn)行差異性分析。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/login.html)是由密歇根大學(xué)的醫(yī)師、科學(xué)家和軟件工程師所搭建的一個(gè)大型腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)。輸入基因?yàn)椤癗NMT”；分析類(lèi)型為“Differential Analysis”-“Cancer vs.Normal Analysis”；腫瘤類(lèi)型為“Gastric Cancer”；數(shù)據(jù)類(lèi)型為“mRNA”。經(jīng)檢索，共得到5 個(gè)研究機(jī)構(gòu)的芯片分析數(shù)據(jù)。選擇可信度較高的“Chen Gastric”，對(duì)NNMT基因進(jìn)行差異性分析。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)

TCGA 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.cancergenome.nih.gov/）是美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）和美國(guó)國(guó)立人類(lèi)基因組研究所（NHGRI）合作開(kāi)發(fā)的一個(gè)項(xiàng)目。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的胃癌病例共有443 例（TCGA-STAD），其中轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)共有380 例。對(duì)TCGASTAD 分類(lèi)中的HTSeq-Counts 數(shù)據(jù)類(lèi)型進(jìn)行下載整理，共得到407例患者組織樣本信息。使用R語(yǔ)言中的“edgeR”包對(duì)其中375 例胃癌組織和32 例癌旁組織的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化并進(jìn)行差異基因的篩選。

1.4 目標(biāo)基因的生物信息學(xué)分析

使用在線分析工具GEPIA［14］及UALCAN［15］在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)NNMT 基因進(jìn)行差異表達(dá)分析；使用KMplotter［16］對(duì)該基因進(jìn)行生存分析；通過(guò)基因集分析工具GSEA3.0（Gene Set Enrichment Analysis）［17］對(duì)NNMT 進(jìn)行單基因及相關(guān)基因集通路富集分析（KEGG）。使用David在線分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能注釋。使用STRING（http://string-db.org/）對(duì)NNMT 及從TCGA-STAD 中篩選到的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析；使用Cytoscape3.7.1軟件的CytoHubba［18］插件，采用12 種算法對(duì)TCGASTAD中篩選到的差異基因進(jìn)行Hub分析，提取每種算法中排名前25 的基因，然后計(jì)算重復(fù)出現(xiàn)的基因個(gè)數(shù)，重復(fù)次數(shù)越多說(shuō)明該基因重要性越高。

1.5 臨床資料收集

收集2017年1～12月南方醫(yī)院普外科28例胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的臨床資料。其中男性16例，女性12例，年齡35～80歲，均為低分化腺癌，依據(jù)TNM分期（2018年AJCC胃癌TNM分期，第八版）其中Ⅱ期10例，Ⅲ期18例，收集患者腫瘤及癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均行根治性切除術(shù)并經(jīng)病理確診為胃癌；（2）術(shù)前未經(jīng)放化療治療；（3）臨床病理特征等資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）臨床病理特征及術(shù)后隨訪資料不完整；（3）未接受手術(shù)治療的胃癌患者；（4）失訪者。本實(shí)驗(yàn)獲得南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.6 標(biāo)本選取與處理

選取癌組織及距腫瘤邊緣>5 cm 處癌旁正常組織。所有組織標(biāo)本離體1 h 內(nèi)經(jīng)生理鹽水洗凈后迅速置于液氮中，速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RNA提取。

1.7 主要試劑和儀器

RNA 提取試劑盒（愛(ài)思進(jìn)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）；SYBR-Green qPCR Mix試劑盒（Roche）；PCR 引物（睿博興科）；NNMT抗體（Proteintech）；山羊抗兔IgG（H+L）-HRP（弗德生物）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（FBS；杭州四季青）。NNMTsiRNA（SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY）。AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27、GES-1 細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室所提供。

1.8 qRT-PCR

依據(jù)Trizol試劑的說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，紫光分光光度計(jì)測(cè)定A260/280的值和總RNA 濃度。將比值在1.8～2.0的RNA 樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并于-20 ℃保存。qRT-PCR 按SYBR Green試劑盒說(shuō)明操作。

引物序列：

5'-ATCCACTGGCGTCTTCAC-3'(GAPDH,Forward)

5'-AGGCATTGCTGATGATCTTGA-3'(GAPDH,Reverse)

5'-GAATCAGGCTTCACCTCCAA-3'(NNMT,Forward)

5'-CCCAGGAGATTATGAAACACC-3'(NNMT,Reverse)

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胃癌細(xì)胞均于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%的CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代、凍存。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將5 μLsiRNA/3 μg 質(zhì)粒與250 μL Opti-MEM 混勻細(xì)胞轉(zhuǎn)染，5 μL Lipo 2000與250 μL Opti-MEM混勻，室溫放置5 min,后將兩部分合并混勻靜置15 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴、均勻加入6孔板中，48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.10 Western blot

收集細(xì)胞并提取總蛋白，加入上樣緩沖液后沸水煮10 min，待冰上冷卻，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，PBST緩沖液洗膜后，加入抗GAPDH或抗NNMT抗體4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后，加入山羊抗兔/鼠二抗（1∶5000），并在搖床上室溫2 h。再次洗膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，使用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光，顯影。

1.11 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)

將5×103/孔的細(xì)胞移植于96孔板，待完全貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染的第0、1、2、3、4、5天每孔各加入10 μLCCK-8試劑，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)A450nm處的光密度值。

1.12 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

預(yù)先在6孔板底做3條標(biāo)記線，標(biāo)記8個(gè)觀察區(qū)域，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染12 h后用10 μL移液器槍頭輕輕地呈“I”劃過(guò)板底，PBS清洗六孔板中的細(xì)胞2遍，換上2%的小牛血清培養(yǎng)基。在劃痕后的0、24、48 h不同時(shí)間點(diǎn)拍照，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的遷移情況。設(shè)置3 個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移距離以劃痕后0 h為參照，計(jì)算劃痕兩側(cè)細(xì)胞遷移距離之和。

1.13 Transwell小室細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)上室加入用200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基配制的2×105/mL 的細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 含20%FBS的1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后撤出小室，PBS洗去培養(yǎng)基，用濕棉棒擦去上室底部膜表面的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗并干燥后鏡下隨機(jī)選3個(gè)視野觀察及計(jì)數(shù)。

1.14 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以500/孔移植于6孔板，每隔2～3 d更換培養(yǎng)基，2 周后PBS 清洗，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min后PBS清洗，待干燥后顯微鏡下觀察拍照，進(jìn)行計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)克隆團(tuán)數(shù)制作圖表。

1.15 數(shù)據(jù)處理

采用R-3.4.1進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理；采用Prism Graphpad 7.0軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NNMT在胃癌中的表達(dá)及生物學(xué)特征的探究

GSE19826表達(dá)譜中，12對(duì)配對(duì)樣本顯示NNMT在腫瘤組織中表達(dá)較癌旁組織顯著上調(diào)（圖1A，P=0.0466），對(duì)GSE13861表達(dá)譜中胃癌的多個(gè)亞型進(jìn)行差異分析，再次顯示NNMT在胃癌中高表達(dá)（圖1B，P=0.016，P=0.0013，P<0.001，P<0.001)。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果同樣顯示NNMT在彌漫型和混合型兩個(gè)胃癌亞型中存在高表達(dá)現(xiàn)象（圖2，P<0.001）。再利用在線分析工具GEPIA和UALCAN對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌芯片數(shù)據(jù)（TCGA-STAD）進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示NNMT不僅在癌組織和正常組織中存在差異表達(dá)（圖3A，B），并且在除Ⅰ期外的不同臨床分期的病變組織中的表達(dá)水平均升高，其中以Ⅳ期腫瘤組織中NNMT 升高最明顯（圖3C，P<0.001）。利用KMplotter工具對(duì)NNMT基因在胃癌樣本中進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示NNMT 高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于NNMT低表達(dá)的患者（圖3D，P<0.001）。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)胃癌組織樣本中的NNMT表達(dá)分析Fig.1 The expressions of NNMT in GEO database.A:The expression of NNMT in GSE19826 dataset;B:The expression of NNMT in GSE13861 dataset.

圖2 NNMT在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)Fig.2 Differential expression of NNMT in Oncomine database.

圖3 NNMT在TCGA-STAD數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)及生存分析Fig.3 Differential expression and survival analysis of NNMT in TCGA-STAD database.A:Differential expression analysis after R language normalization;B:Differential analysis of NNMT between cancer tissues and normal tissues by UALCAN;C:Differential analysis of NNMT in gastric cancer tissues in different stages by UALCAN;D:Online survival analysis with UALCAN.

使用GSEA軟件進(jìn)行NNMT的單基因KEGG通路富集分析以明確NNMT 的生物學(xué)功能（圖4A）。NNMT 高表達(dá)表型通路分析結(jié)果顯示：細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（圖4B），造血細(xì)胞系（圖4C），粘著斑（圖4D），細(xì)胞因子受體相互作用（圖4E），細(xì)胞黏附分子（圖4F）。而在NNMT低表達(dá)表型組的通路富集結(jié)果顯示胃癌中NNMT的低表達(dá)可能與以下生物學(xué)過(guò)程相關(guān)：堿基切除修復(fù)（圖4G），錯(cuò)配修復(fù)（圖4H），核黃素代謝（圖4I）。

圖4 NNMT單基因GSEA分析Fig.4 Single-gene GSEA analysis of NNMT.A：GSEA analysis report;B：ECM receptor interaction pathway;C：Hematopoietic cell lineage pathway;D：Focal adhesion pathway;E：Cytokine receptor interaction pathway;F：Cell adhesion mole-cules,CAMs pathway;G:Base excision repair pathway;H：Mismatch repair pathway;I:Riboflavin metabolism pathwa.

為進(jìn)一步探究NNMT與TCGA-STAD中得到的差異表達(dá)基因之間的關(guān)系，將所有差異基因和NNMT通過(guò)STRING進(jìn)行PPI（蛋白互作網(wǎng)絡(luò)）分析，結(jié)果顯示,NNMT與AURKA等16個(gè)蛋白存在互相作用關(guān)系，且與TAGLN、PTRF、AKAP12、IGF2BP2蛋白存在較高的共表達(dá)情況（相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.6，表1，圖5）。最后，使用Cytoscape軟件提供的12種算法，對(duì)用于PPI分析的前2000個(gè)差異基因（不包括NNMT）進(jìn)行拓?fù)浞治?，并?gòu)建Hub基因網(wǎng)絡(luò)（圖6），然后提取在所有網(wǎng)絡(luò)中高頻次出現(xiàn)的10個(gè)基因：CDK1，BRCA1，RAD51，TOP2A，AURKA，MAPK3，JUN，EZH2，HSP90AA1，AR（表2）。

表1 NNMT與差異基因的PPITab.1 PPI of NNMT and differentially expressed genes

圖5 NNMT與TCGA-STAD差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 PPI analysis of NNMT and TCGA-STAD differential genes.

圖6 TCGA-STAD中的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.6 Construction of crucial genetic network in TCGA-STAD.

2.2 NNMT在胃癌組織樣本中高表達(dá)

NNMT和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白的熔解曲線均為單峰特異（圖7A），引物特異性好，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均為0.998，PCR擴(kuò)增效率恒定且接近100%。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，癌組織中NNMT mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（P=0.0466，圖7B）。

圖7 NNMT 在胃癌組織樣本中的表達(dá)分析Fig.7 NNMT expression in clinically derived gastric cancer samples.A:qRT-PCR dissolution curve;B:Relative expression of NNMT in samples.

2.3 NNMT過(guò)表達(dá)及干擾細(xì)胞株的構(gòu)建

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SGC7901、MGC803和BGC823細(xì)胞株高表達(dá)NNMT，而MKN45、HGC27和AGS 細(xì)胞株低表達(dá)NNMT（圖8A）。因MKN45 的GAPDH與其他蛋白差異較大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)未使用該細(xì)胞株。其他蛋白表達(dá)結(jié)果與qRT-PCR的結(jié)果基本保持一致（圖8B）。故選用SGC7901和MGC803細(xì)胞株構(gòu)建NNMT敲除細(xì)胞株，HGC27和AGS細(xì)胞株構(gòu)建NNMT過(guò)表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成功構(gòu)建了NNMT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體，并購(gòu)買(mǎi)NNMT干擾片段進(jìn)行細(xì)胞模型的構(gòu)建。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)細(xì)胞株AGS中NNMT的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P=0.0044）；干擾NNMT 的SGC7901 細(xì)胞株則明顯降低（P=0.01，圖9B、C）。

圖8 胃癌細(xì)胞中NNMT的表達(dá)Fig.8 NNMT expression in gastric cancer cells.A:Western blot;B:qRT-PCR experiment.

圖9 NNMT過(guò)表達(dá)和干擾胃癌細(xì)胞株的構(gòu)建Fig.9 Overexpression and knockdown of NNMT in gastric cancer cell lines.A:Western blot results.B:Expression of NNMT mRNA in AGS by qRT-PCR;C:Expression of NNMT mRNA in SGC7901 by qRT-PCR.

2.4 NNMT對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響

CCK8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)NNMT 的AGS 細(xì)胞增殖能力增加；干擾NNMT的SGC7901細(xì)胞的增殖能力降低（P<0.001，圖10C）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也觀察到相同的趨勢(shì)（P<0.01，圖10F～G）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)NNMT的AGS遷移能力增加（P<0.001，圖10A），干擾NNMT 的SGC7901 細(xì)胞株遷移能力減弱（P<0.001，圖10B）。與Transwell小室細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果相同（P<0.01，圖10D～E）。

圖10 NNMT 對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響Fig.10 Effect of NNMT expression modulation on biological function of gastric cancer cells.A:AGS cell migration test;B:7901cell migration test;C:Results of AGS and 7901cck8 determination;D:Transwell results of AGS;E:Transwell results of 7901;F:AGS cloning formation experiment;G:SGC7901 cloning formation experiment.

3 討論

目前已知原癌基因的激活和抑癌基因的失活對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展有重要的作用［19-21］。關(guān)于NNMT與腫瘤的研究，有研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在高級(jí)別卵巢漿液性癌中發(fā)現(xiàn)在發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織間質(zhì)中NNMT呈高表達(dá)狀態(tài)［22］，其通過(guò)調(diào)節(jié)DNA 和組蛋白甲基化以驅(qū)動(dòng)CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）表型的變化，對(duì)于CAF標(biāo)志物的表達(dá)、細(xì)胞因子及腫瘤相關(guān)性細(xì)胞外基質(zhì)的分泌具有重要的作用；間質(zhì)NNMT的表達(dá)會(huì)促進(jìn)高級(jí)別卵巢漿液性癌的進(jìn)展，與臨床的不良預(yù)后相關(guān)。另有一些研究發(fā)現(xiàn)NNMT的下調(diào)導(dǎo)致膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)［23］；NNMT上調(diào)與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，并與無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總體生存時(shí)間的延長(zhǎng)有關(guān)［24］。本研究通過(guò)GEO、Oncomine和TCGA 3大腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選出NNMT，驗(yàn)證其在胃癌中高表達(dá)，具有原癌基因特性。與先前報(bào)道一致，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NNMT的mRNA水平高于癌旁組織；與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比胃癌細(xì)胞中NNMT的表達(dá)上調(diào)。我們還通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，NNMT在除Ⅰ期外的不同臨床分期的病變組織中的表達(dá)水平均升高，以Ⅳ期腫瘤組織中NNMT升高最明顯，并且NNMT表達(dá)與癌癥進(jìn)展（Ⅰ～Ⅳ期）顯著正相關(guān)。這提示NNMT高表達(dá)可作為胃癌進(jìn)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)。進(jìn)一步利用TCGA-STAD進(jìn)行KMplotter生存分析可以發(fā)現(xiàn)NNMT高表達(dá)的胃癌患者生存期更短，提示NNMT高表達(dá)患者預(yù)后更差。

NNMT影響多種癌癥細(xì)胞的增殖，遷移，侵襲和分化能力［25］。有文獻(xiàn)表明，PI3K/Akt通路在NNMT誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和MMP-2激活中起著至關(guān)重要的作用［26］。NNMT通過(guò)穩(wěn)定SIRT1的活性來(lái)增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［27］；SIRT1 的活性降低削弱了乳腺癌中NNMT對(duì)阿霉素和紫杉醇的抗性作用［28］。但是NNMT在胃癌中的功能機(jī)制和相互作用蛋白仍然有待探索。本研究利用GSEA 單基因富集分析的方法對(duì)TCGASTAD中篩選出胃癌相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們觀察到NNMT的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、造血細(xì)胞系、粘著斑、細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附分子等信號(hào)通路存在潛在的相關(guān)性，這些通路對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［29］，金屬離子激活等起著重要作用［30］，并參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程。而NNMT表達(dá)下調(diào)則可能與堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、核黃素代謝相關(guān)，這些生物過(guò)程參與腫瘤細(xì)胞的增殖和分化［31-33］。可見(jiàn)，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因，多步驟參與的復(fù)雜過(guò)程，以上發(fā)現(xiàn)有助于揭示NNMT在胃癌中的作用和加強(qiáng)對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的了解。

蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析能夠?qū)哟吻逦卣故净蜷g的相互關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵作用基因及其調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)提供重要預(yù)測(cè)價(jià)值。因此，我們將NNMT與TCGASTAD中得到的差異基因進(jìn)行PPI分析，共得到16個(gè)與NNMT 存在互相作用關(guān)系的基因，且發(fā)現(xiàn)TAGLN、PTRF、AKAP12、IGF2BP2 基因與NNMT 存在較強(qiáng)的共表達(dá)關(guān)系。同時(shí)，我們使用Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行更深層次的Hub基因挖掘，進(jìn)一步得到高頻次出現(xiàn)的10個(gè)基因：CDK1，BRCA1，RAD51，TOP2A，AURKA，MAPK3，JUN，EZH2，HSP90AA1和AR。這些基因的作用主要體現(xiàn)在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、DNA合成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面。兩次分析結(jié)果交叉比對(duì)顯示AURKA是唯一重復(fù)出現(xiàn)的基因，提示AURKA是與NNMT具有潛在聯(lián)系的重要基因。AURKA編碼的蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的激酶，在染色體分離過(guò)程中參與微管的形成和紡錘體極點(diǎn)的穩(wěn)定。AURKA在包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥中過(guò)表達(dá)，并且促進(jìn)癌癥的進(jìn)展［34-35］。目前在胃癌中尚未有這兩個(gè)基因互作關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)NNMT與AURKA在胃癌中的互作機(jī)制。

綜上所述，NNMT可能在預(yù)測(cè)胃癌的進(jìn)展和預(yù)后方法有較大價(jià)值，但是否是一個(gè)候選的胃癌預(yù)后標(biāo)志物，有待更進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。