何佳寧，梁東生，梁悅娥，左詩雅，趙望泓

1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510515；2中山大學附屬中山市人民醫(yī)院口腔科，廣東 中山 528400

世界衛(wèi)生組織將口腔疾病與心腦血管疾病、癌癥、糖尿病等并列為五大重點防治慢性病?？谇患膊≈旋x病的患病率高居所有慢性疾病首位，影響全球10%以上的人口［1］。第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查結(jié)果顯示［2］，5、12歲兒童的患齲率分別為70.9%、34.5%，兒童患齲情況已呈現(xiàn)上升態(tài)勢。齲病的危害不僅僅局限于影響牙齒本身的功能與美觀，還體現(xiàn)在由其帶來的一系列繼發(fā)病癥，并且與全身系統(tǒng)性疾病如心血管疾病等具有一定的相關性［3］。老年患者的認知能力下降與牙齒缺失數(shù)或齲齒數(shù)的增加有關［4］。雖然采取了預防措施，但齲病控制的效果仍不理想，因此齲病防治仍舊面臨較大的挑戰(zhàn)。以細菌為主的牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的始動因子。其中，與人類齲病發(fā)生最密切相關的是變異鏈球菌（S.mutans）。因此，抑制變異鏈球菌的生長對于防治齲病具有重要意義。

近年來，臨床廣泛使用抗菌劑作為口腔輔助用藥，但長期使用抗生素會引起一定的毒性和副作用，導致菌群失衡和抗生素耐藥性的發(fā)生［5］?？咕氖菑V泛存在于生物體天然免疫防御系統(tǒng)的一類小分子多肽類物質(zhì)，具有較強的生物活性，不僅可殺滅革蘭氏陽性/陰性細菌、真菌、病毒，而且對傳統(tǒng)抗生素耐藥菌亦有較好的抑制作用［6］。與傳統(tǒng)抗生素不同，抗菌肽通過物理正負電性相互吸引的作用，正電性的抗菌肽與表面帶負電的細菌細胞膜結(jié)合，破壞其完整性，使胞內(nèi)容物泄漏，導致細胞死亡［7-8］?？咕莫毺氐目咕鷻C制使其不易產(chǎn)生耐藥性，對某些耐藥性較強的病原微生物也可發(fā)揮一定的殺菌或抑菌作用。

Histatins5是存在于人和一些高級靈長類動物唾液中的一類天然抗菌肽，可對白色念珠菌發(fā)揮有效的殺滅作用［9］。1997 年，Helmerhorst 等［10］根據(jù)抗真菌肽Histatin5的活性結(jié)構(gòu)區(qū)域，設計并合成了多種類似物，Dhvar4是Histatin5最具代表性的類似物之一。在結(jié)構(gòu)和功能方面，Dhvar4擁有更優(yōu)的兩親性和抗菌活性以及較低的溶血活性和細胞毒性［11-12］。研究表明，與天然抗菌肽（AMP）相比，合成抗菌肽可具有更有效和更廣譜的抗菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性限制，且細胞毒性較低［13］。

目前許多學者成功設計并合成了具有良好抗菌活性的抗菌肽，如ZXR-2［14］，DPS-PI［15］等，對齲病病原菌變異鏈球菌顯示出明顯的抗菌作用。許多天然和合成的抗菌肽已被證實對細菌及相關致病毒力因子有抑制作用，越來越多的具有各種性質(zhì)的新型抗菌肽正在被發(fā)現(xiàn)或合成，例如GH12不僅可抑制口腔鏈球菌的活性，還可抑制細菌致齲性以及改變多種生物膜組成［16］；TVH19抗菌肽不僅有抗菌的作用，還兼具有促進再礦化的能力［17］；雖然諸多研究顯示抗菌肽在臨床應用中的巨大潛力［18］，但基于此開發(fā)的新型藥物仍然很有限，這是因為大多數(shù)抗菌肽仍具有一定的局限性，比如肽鏈較長，空間結(jié)構(gòu)復雜，導致生產(chǎn)成本高，合成難度大［19］。

本研究參考α-螺旋抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點，對Dhvar4進行進一步優(yōu)化設計，保證其較短肽鏈的同時提高兩親性和疏水性。短鏈抗菌肽可以更高效迅速的合成和修飾，其結(jié)構(gòu)和功能也更易于設計及預測；提高兩親性和疏水性則對抗菌肽與細胞膜結(jié)合的能力及抗菌活性進一步提升。因此，本研究立足于設計并篩選出高活性、低毒性的新型短鏈抗菌肽，探究其對S.mutans及其生物膜，以及其他口腔常見鏈球菌的作用效果，評估其開發(fā)為新型口腔抗菌藥物的潛在應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株 S.mutans ATCC 25175、糞腸球菌（E.faecalis）ATCC29212、遠緣鏈球菌（S.sobrinus）ATCC33478、戈登鏈球菌（S.gordonii）ATCC10558、血鏈球菌（S.sanguinis）JCM5708購自廣東省菌種保藏中心（GDMCC）。原代人牙齦成纖維細胞（HGFs）取自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院口腔科正畸拔牙患者（經(jīng)知情同意，倫理號：NFEC-2017-017）。

1.1.2 實驗藥物 Dhvar4及其衍生肽KR-1、KR-2由上海淘普生物科技有限公司使用標準的Fmoc固相肽合成方案合成。利用反相HPLC 純化目的產(chǎn)物，純度達95%以上。

1.1.3 主要試劑 腦心浸液（BHI）肉湯、瓊脂（青島海博）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；磷酸鹽緩沖液（Gibco）；CCK-8試劑盒（Dojindo）；醋酸氯己定（上海源葉）；LIVE/DEAD BacLightTM細菌生存力試劑盒（Molecular Probes）；1%Triton-X 100溶液（北京雷根）；4%兔紅細胞（廣州鴻泉）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽的設計 通過Prabi 網(wǎng)站（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）以Dhvar4 序列作為模版。通過Heliquest網(wǎng)站（http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/）獲得Dhvar4的極性面和非極性面上氨基酸的信息，根據(jù)兩親性正電性α-螺旋型抗菌肽的設計理念，使用疏水性氨基酸替代親水性氨基酸，由此合成了Dhvar4（序列：KRLFKKLLFSLRKY-NH2，相對分子質(zhì)量：1839.35）及2 個 衍 生 肽 序 列KR-1 及KR-2（KR-1 序 列：KRLFKKLLFWLRKY-NH2，相對分子質(zhì)量：1938.49；KR-2序列：KRLFKKLLFWLRKW-NH2，相對分子質(zhì)量：1961.52）。

1.2.2 抗菌肽的篩選

1.2.2.1 細菌培養(yǎng)及細胞培養(yǎng) 將S.mutansATCC 25175、E.faecalis ATCC29212、S.sobrinus ATCC33478、S.gordonii ATCC10558、S.sanguinis JCM5708 接種培養(yǎng)于腦心浸液（BHI）肉湯，于37 ℃、厭氧環(huán)境（80%N2、10%CO2和10%H2）中孵育過夜。HGFs培養(yǎng)于含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2 抗菌活性評價 遵循臨床和實驗室標準協(xié)會推薦［20］，使用二倍稀釋法在96 孔微量滴定板中分別對KR-1、KR-2進行抗菌活性測定［21］，分別檢測其最小抑菌濃度（MICs）和最小殺菌濃度（MBCs）。在96孔板上用BHI肉湯將抗菌肽KR-1及KR-2二倍稀釋后加入等體積生長對數(shù)期的S.mutans ATCC 25175，各抗菌肽終濃度為3.2～25.6 μmol/L，細菌終濃度為1×106CFU/mL，每孔溶液終體積為200 μL。37 ℃厭氧環(huán)境中培育16～24 h，最低濃度的無渾濁孔為MIC，并從所有澄清實驗孔中取50 μL等分試樣至BHI平板上，37 ℃厭氧環(huán)境孵育48 h，無細菌生長的最低濃度為MBC。

1.2.2.3 生物相容性評價 生物相容性評價包括溶血活性和細胞毒性兩部分。

用PBS緩沖液將新鮮兔血紅細胞輕輕洗滌3遍，1000 g，4℃離心10min后重懸于PBS緩沖液中。使用PBS對抗菌肽KR-1、KR-2二倍稀釋后加入等體積兔血紅細胞重懸液，各抗菌肽終濃度為3.2～51.2 μmol/L，每孔溶液終體積為200 μL。在37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后離心，取上清測定波長為405 nm時各實驗孔A值，每組設立3個副孔。

將生長狀況良好的第3 代人牙齦成纖維細胞（HGFs）接種至96微孔板中，接種濃度為5×103細胞/孔，37 ℃、含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。移除上清后分別加入經(jīng)二倍稀釋的KR-1、KR-2抗菌肽溶液，濃度范圍為3.2～51.2 μmol/L，培養(yǎng)24 h后去除上清。加入10%CCK-8溶液孵育2 h。使用酶標儀檢測各孔A值，檢測波長450 nm。每組設立3個副孔。

1.2.3 目標抗菌肽對S.mutans生物膜的作用 抗生物膜效果評價包括對生物膜形成的影響和清除成熟生物膜的效果兩部分。

參考O'Toole等［22］的結(jié)晶紫染色實驗，探討目標抗菌肽對變異鏈球菌生物膜形成的影響。設置實驗組KR-1和陽性對照組CHX，用含1.00%（w/v）蔗糖的BHI肉湯將其稀釋至0.6×、0.8×、1×、2×MICs濃度，細菌終濃度為1.0×106CFU/mL。37 ℃下厭氧孵育24 h，去除上清后用PBS 輕洗3 次，清除未黏附細菌，甲醇固定15 min后使用0.1%（w/v）結(jié)晶紫溶液染色5 min，PBS洗去多余染料，風干。向每孔中添加200 μL的95.00%乙醇，室溫下避光震蕩30 min，使用酶標儀測定波長為595 nm時每孔的A值。每組設立3個副孔。

使用LIVE/DEAD BacLightTM細菌生存力試劑盒染色并在共聚焦顯微鏡下觀察，評估目標抗菌肽作用于成熟生物膜后死/活菌分布以及形態(tài)學改變。設置實驗組KR-1，陽性對照組CHX和空白對照組BHI。將無菌細胞爬片置于6孔板中，并用含1.00%（w/v）蔗糖的BHI肉湯將生長對數(shù)期的S.mutans ATCC 25175調(diào)整至終濃度為1.0×106CFU/mL加入其中，37 ℃、厭氧環(huán)境中孵育24 h。去除未黏附的浮游細菌，各處理組加入終濃度為各自對應S.mutans ATCC 25175的10×MICs 濃度的藥物，空白對照組僅加入BHI溶液。37 ℃、厭氧環(huán)境中孵育24 h。去上清并用PBS緩緩清洗3次。將等比例的SYTO?9和碘化丙啶混合加至細胞爬片，室溫下于黑暗中放置15 min。將細胞爬片置于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡×63油鏡觀察，隨機選擇3個視野進行拍照。

1.2.4 目標抗菌肽對其他口腔鏈球菌的作用

1.2.4.1 抗菌活性評價 仍通過二倍稀釋法在96孔板中檢測目標抗菌肽的最小抑菌濃度（MICs）和最小殺菌濃度（MBCs）進行抗菌活性評價［20-21］。配置KR-1二倍稀釋液，用BHI肉湯調(diào)節(jié)生長對數(shù)期的細菌懸浮液并1∶1加入抗菌肽稀釋液中，每孔液體終體積為200.0 μL，細菌終濃度為1.0×106CFU/mL，抗菌肽終濃度為3.2～102.4 μmol/L。使用BHI 肉湯作為空白對照組。37 ℃，厭氧孵育16～24 h，肉眼觀察96孔板各實驗孔的渾濁程度，無渾濁的最低濃度作為MIC。從所有澄清實驗孔中取50.0 μL等分試樣至BHI平板上，37 ℃下厭氧孵育48 h，完全抑制細菌生長的最低濃度為MBC。對所有菌株進行3次MICs和MBCs測定。

1.2.4.2 殺菌-時效評價 使用殺菌-時效實驗評估抗菌肽對口腔中細菌的短效殺菌作用［23］。使用無菌BHI肉湯將目標抗菌肽分別稀釋至S.mutans 所對應的1×MBCs和2×MBCs，即6.4 μmol/L和12.8 μmol/L，其中加入生長對數(shù)期，終濃度為1×106CFU/mL的細菌，終體積為200 μL。37℃孵育0、1、3、5、10、20、30 min后取出等分試樣（10.0 μL）至PBS 中稀釋后在BHI 瓊脂上涂板，37 ℃厭氧孵育48 h計數(shù)存活菌落數(shù)，構(gòu)建了抗菌肽的殺菌時效曲線。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0軟件，通過t檢驗或單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。所有實驗都獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽的設計

本實驗根據(jù)Histatin5來源的Dhvar4序列進一步進行修飾和加工得到新型抗菌肽KR-1、KR-2。分析獲得Dhvar4的極性面和非極性面上氨基酸的信息后，使用色氨酸替代絲氨酸以及使用色氨酸替代絲氨酸和碳端的酪氨酸，分別構(gòu)建Dhvar4的2個衍生肽序列（表1，圖1）。

圖1 Dhvar4及其衍生肽的螺旋示意圖Fig.1 Helical wheel of Dhvar4 and its derivatives.A:Dhvar4.B:KR-1.C:KR-2.The hydrophilic residues are highlighted in blue and the hydrophobic residues in yellow.

2.2 目標抗菌肽的篩選

2.2.1 KR-1具有比KR-2相對較強的抗菌活性 改造后的多肽疏水性提高，但對S.mutans ATCC25175的抗菌活性卻分別升高和降低（表1）。KR-1 對于S.mutans ATCC25175的MIC為3.2 μmol/L，MBC為6.4 μmol/L，低于Dhvar4和KR-2，抗菌活性相對較強。

表1 Dhvar4及其衍生肽的理化性質(zhì)及抗菌活性Tab.1 Physicochemical properties and antibacterial activity of Dhvar4 and its derivative peptides

2.2.2 KR-1具有比KR-2相對較好的生物相容性 相同作用濃度時，KR-1比KR-2對新鮮兔紅細胞的溶血性更低（圖2）；MIC濃度下，KR-1作用于兔血紅細胞的溶血率僅約為0.35%；但當濃度進一步提高時，抗菌肽的溶血活性呈劑量依賴性增加。

圖2 Dhvar4衍生肽對新鮮兔紅細胞的溶血活性Fig.2 Hemolytic activity of Dhvar4-derived peptides in fresh rabbit red blood cells.*P<0.05,**P<0.01.

當使用濃度不高于6.4 μmol/L的抗菌肽處理時，KR-1、KR-2對HGFs的毒性均低于陽性對照藥物阿霉素（圖3A）。當使用KR-1有效抑菌濃度（3.2 μmol/L）處理時，HGFs 存活率高達72.96%；使用有效殺菌濃度（6.4 μmol/L）處理時，HGFs存活率也達到70.11%。當分別對比KR-1和KR-2有效作用濃度時，KR-1毒性顯著低于KR-2（圖3B）。

圖3 Dhvar4衍生肽對人牙齦成纖維細胞（HGFs）產(chǎn)生的細胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of Dhvar4-derived peptides in human gingival fibroblasts(HGFs).A:Toxicity of the antimicrobial peptides at different concentrations.B:Toxicity of the antimicrobial peptides at their effective concentrations.*P<0.05,**P<0.01.

2.3 KR-1對S.mutans生物膜具有較好的抑制與清除作用

KR-1可有效抑制S.mutans 生物膜形成，抑制效果呈濃度依賴性（圖4）。當KR-1的作用濃度為0.6×MIC時，S.mutans生物膜形成率僅約為11%，KR-1的50%生物膜最小抑制濃度（MBIC50）低于1.92 μmol/L，與陽性對照藥物CHX作用效果相當。而當作用濃度增大至0.8×MIC，KR-1對S.mutans生物膜的抑制效果優(yōu)于CHX。

圖4 KR-1對S.mutans生物膜抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of KR-1 on S.mutans biofilm.**P<0.01.

共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察結(jié)果示，染料SYTO?9和PI的混合物分別對帶有完整細胞膜的活細菌染色為熒光綠色，對帶有損壞細胞膜的死細菌染色熒光紅色。陰性對照組中，S.mutans ATCC 25175 能形成較致密而厚的生物膜，紅色熒光信號較弱。當在已形成的S.mutans 生物膜中加入KR-1和CHX后，細菌生物膜活性明顯降低，紅色熒光信號增多，而且生物膜較疏松（圖5）。

圖5 KR-1對S.mutans成熟生物膜的影響Fig.5 Effect of KR-1 on mature S.mutans biofilm.

2.4 KR-1對其他口腔鏈球菌也具有抗菌活性

KR-1對其他較常見的口腔鏈球菌也具有一定的作用（表2），但對不同細菌作用效果均有所差異，其對于S.mutans ATCC 25175的抗菌活性最好，MIC為3.2 μmol/L，MBC為6.4 μmol/L；對于S.sobrinus的作用效果較差，51.2 μmol/L的KR-1才能抑制其生長，而殺菌濃度則要大于102.4 μmol/L。然而糞腸球菌對于KR-1的敏感性很低，KR-1無法殺滅糞腸球菌，并且對其生長也沒有明顯抑制作用。

表2 KR-1對其他口腔鏈球菌的抗菌活性Tab.2 Antibacterial activity of KR-1 against other oral Streptococci species

通過殺菌時效實驗，進一步對抗菌肽的抗菌活性進行驗證，MBC（6.4 μmol/L）濃度的KR-1作用下，5 min內(nèi)可降低約95%的S.mutans ATCC 25175，對于其他口腔鏈球菌的作用也是在5 min 內(nèi)即可殺滅90%以上（圖6A）；2MBC（12.8 μmol/L）濃度的KR-1作用下趨勢類似（圖6B），其對于S.mutans ATCC 25175的作用更加迅速，1 min內(nèi)即可下降約98%，對于其他口腔鏈球菌的殺滅效果也更加迅速。

圖6 KR-1對口腔鏈球菌的殺菌時效曲線Fig.6 Time-killing curve of KR-1 at 6.4 μmol/L(A)and 12.8 μmol/L(B)against oral streptococcus.

3 討論

目前抗菌肽在細菌性疾病防治中的研究已經(jīng)較為廣泛，但仍有部分局限性例如殺菌效率較低、生產(chǎn)成本昂貴、合成具有不穩(wěn)定性等。本研究以天然抗菌肽的類似物Dhvar4為模板，運用兩親性正電性α-螺旋抗菌肽的設計理念，采用殘基替換的方式，對其結(jié)構(gòu)進行改造，設計出新型抗菌肽測定其抗菌活性，篩選出了高活性低毒性且殺菌較為迅速的短鏈抗菌肽KR-1。目前自然界存在的抗菌肽相對分子質(zhì)量一般在2000～7000左右，由20～60個氨基酸殘基組成。本研究合成并篩選出的目標抗菌肽KR-1分子量為1938.49，且僅含14個氨基酸，結(jié)構(gòu)為線性短肽，合成簡單且成本低，肽鏈穩(wěn)定性較高，不易發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化。

KR-1的結(jié)構(gòu)符合兩親性正電性α-螺旋抗菌肽的設計原則。由于色氨酸具有疏水性，本研究中使用色氨酸替換非極性面上帶電性氨基酸和弱疏水性氨基酸。Liang等［24］研究表明，多肽疏水性與抗菌活性之間具有明顯的正比相關，疏水性決定了抗菌肽破裂菌膜的能力，疏水性越高，抗菌活性越強。然而本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)改造設計后，KR-1、KR-2的疏水性均大于Dhvar4，但疏水性最強的KR-2，MIC反而最高，也就是說，當抗菌肽的疏水性超過某個特定的閾值時，隨著疏水性的增加，可能抗菌活性反而降低，所以成功設計高活性抗菌肽需要恰當提高其疏水性。有研究發(fā)現(xiàn)［25］，超過6個凈正電荷時抗菌肽抗菌活性提升不明顯，甚至可能會因為同名電荷之間相互排斥而活性降低，帶有4～6個正電荷的抗菌肽往往具有較好的抗菌活性。因此，本研究構(gòu)建的KR-1、KR-2抗菌肽帶有6個凈正電荷，結(jié)合適當?shù)氖杷栽O計，成功合成具有理論可行性的新型抗菌肽，后續(xù)的抗菌活性實驗結(jié)果也進一步證明了此結(jié)論。

生物相容性的對比也是篩選目標抗菌肽中的重要環(huán)節(jié)。本研究中的KR-1、KR-2 是對Histatin5 衍生肽Dhvar4再次設計優(yōu)化。Histatin5作為人源性抗菌肽具有人類唾液的正常成分優(yōu)勢，對宿主組織沒有明顯的不良影響［26］。但經(jīng)活性改造后毒性往往會增加，隨著結(jié)構(gòu)上疏水性的增加，細胞毒性往往也隨之增加［27］，實驗證明，高濃度的抗菌肽確實對HGFs產(chǎn)生了一定的細胞毒性，但在藥物有效濃度內(nèi)，即MIC濃度下，KR-1作用于兔血紅細胞的溶血率僅約為0.35%，作用于HGFs存活率高達92.43%，這反映KR-1仍然具有較好的生物相容性，因此若嚴格控制處理時間，可能難以產(chǎn)生明顯的毒副作用。

牙菌斑生物膜是導致齲病發(fā)生的始動因子，因此在藥物防齲方面，抑制S.mutans 生物膜的形成和清除成熟生物膜具有重要意義［28］。KR-1能夠明顯減少形成的生物膜量，使用0.6×MIC的KR-1時，在抑制生物膜形成方面的效果與陽性對照藥物CHX相當。隨著作用濃度增大，KR-1對S.mutans生物膜的抑制效果優(yōu)于CHX。這表明其具有良好的體外抑制S.mutans生物膜的效果；共聚焦顯微鏡定性結(jié)果示，KR-1也比CHX能更高效地清除成熟的S.mutans 生物膜；經(jīng)抗菌肽處理后的S.mutans 生物膜變得不完整和疏松，這可能使后續(xù)的機械清除變得更加高效。因此，KR-1或許能夠成為一種有效的抗生物膜藥物，尤其是抗S.mutans生物膜。

KR-1不僅能夠有效抑制口腔致齲菌S.mutans 的活性，還可以抑制其他口腔致病菌的活性，比如其他齲病相關的病原菌S.sobrinus 和S.gordonii。因此KR-1或許可用于口腔細菌感染性疾病的預防和治療。KR-1具有較為快速的殺菌能力，在特定時間內(nèi)，S.mutans ATCC 25175 對KR-1 的敏感性較其他實驗組細菌更高。值得注意的是，在一定時間內(nèi)相對于其他口腔致病菌，KR-1表現(xiàn)出對S.sanguinis較低的敏感性?？谇怀ｑv菌S.sanguinis目前被認為是口腔有益菌，研究表明［29］S.sanguinis可顯著減弱S.mutans在口腔和牙面定植，降低高度致齲的條件下光滑面齲的嚴重程度。KR-1更有選擇性地抑制高致齲性鏈球菌的生長和代謝，在較少影響口腔有益菌的情況下對致病菌表現(xiàn)出較強烈的作用，而不會強烈影響低致齲性鏈球菌，對維護口腔常駐的“健康”微生物群落的穩(wěn)定具有重要意義。

時效實驗測量了抗菌肽殺滅細菌的速度，結(jié)果表明，KR-1對被測菌株作用迅速，隨著肽濃度增加，殺滅時間降低。KR-1對口腔常見致病菌的最佳體外處理時間為1～3 min，此時間可殺滅約93%的S.mutans。一般來說，口腔沖洗用藥及含漱液在口腔內(nèi)停留時間較短，日常刷牙時間也在3 min左右，該作用效果符合口腔科用藥規(guī)律，KR-1的快速殺菌性能增加了其臨床應用的潛力。

然而，本研究也具有一定局限性，人類牙齒表面和口腔軟組織上存在著700多種細菌，牙菌斑也是由多種細菌構(gòu)成的生物膜［30］，可導致多種口腔疾病包括齲齒、牙髓炎、牙齦炎和牙周炎等疾?。?1-32］。本篇研究的范圍僅涉及KR-1對變異鏈球菌及部分口腔鏈球菌的作用效果，今后還需要觀察KR-1對含有多種細菌的復雜菌斑生物膜的影響，并使用動物模型模擬更真實的口腔微生物環(huán)境，進一步研究KR-1對齲病以及其他口腔細菌性疾病的防治效果。

本研究設計、構(gòu)建并篩選出了具有高活性且低毒性的新型抗菌肽KR-1，對多種口腔致病菌具有快速、高效的抑制及殺滅作用；結(jié)果表明，其在有效濃度內(nèi)具有較好的生物相容性，短時間內(nèi)具有一定的殺菌選擇性，還具有良好的抗生物膜特性，有望成為防治口腔細菌性疾病的新型藥物，尤其在齲病防治領域可提供新的思路。