何庚翰，陶 泉，劉 闖，張 迪，周宇平，劉瑞源

南方醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510515

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一［1-2］，對其進(jìn)行診斷和治療是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)［3］。磁共振成像（MRI）因其具有高空間分辨率［4］、深層軟組織穿透力［5-6］和無創(chuàng)成像［7］等優(yōu)點(diǎn)，是目前用于腫瘤檢查和診斷的主要方式［8-10］。在腫瘤治療方面，光熱治療（PTT）是一種極具潛力的新型腫瘤治療方式，一般通過靶向基團(tuán)將近紅外吸收劑特異性地輸送到腫瘤部位［11-12］，在近紅外激光的照射下，有效地將光能轉(zhuǎn)換為熱能并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡［13-17］，可最大限度地減少對周圍正常組織的損傷［18］，具有低副作用［19-20］、高效性和生物安全性等優(yōu)點(diǎn)［21-22］。

普魯士藍(lán)納米粒子是由過渡金屬離子或者鑭系元素通過氰基橋聯(lián)配體組裝而成的一種無機(jī)納米粒子［23-25］，具有生產(chǎn)成本低、分子結(jié)構(gòu)可調(diào)、孔隙率高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)［26］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤的光聲成像、磁共振成像、超聲成像、光熱治療及藥物載體等多種領(lǐng)域［27-32］，是構(gòu)建診療一體化探針的理想材料。

在普魯士藍(lán)眾多的合成方法中，微乳液法是一種較為新型的合成方法。微乳液是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按一定的比例混合形成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系。在W/O型微乳液體系中，其內(nèi)部的球狀水滴直徑通常很小（僅50～80 nm），是制備納米材料的理想“反應(yīng)容器”。與傳統(tǒng)的合成方式相比，通過改變微乳液的體系結(jié)構(gòu)可以方便地對納米顆粒的粒徑大小、形貌以及分散性進(jìn)行有效控制。Mn2+摻雜的普魯士藍(lán)納米顆粒因在增強(qiáng)磁共振成像效果的同時可以提供良好的光熱治療效果，具備向臨床診療一體化探針轉(zhuǎn)化的巨大潛力而備受關(guān)注。然而通過微乳液法對Mn2+摻雜的普魯士藍(lán)納米顆粒的粒徑大小進(jìn)行控制合成的研究未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用Triton X-100微乳液體系成功制備了摻雜Mn2+的普魯士藍(lán)納米顆粒，利用動態(tài)光散射（DLS）、電泳光散射（ELS）、傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）、紫外吸收光譜分析（UV-vis）技術(shù)對納米顆粒進(jìn)行理化性能表征，并考察了其體外T1-T2雙模態(tài)磁共振成像效果及對HepG2細(xì)胞的光熱治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

酶聯(lián)免疫分析儀（BIOTEKELX80）、納米粒度電位儀（布魯克海文NanoBrook 90PlusZeta）、紫外-可見光吸收光譜儀（Thermo Fisher Evolution 300）、傅里葉紅外光譜儀（Thermo Fisher Nicolet iS50 FT-IR）、手持紅外熱成像儀（Fluke TiS20）、激光器（長春鐳銳光電科技，LR-MFJ-808/5000 mW）、倒置熒光顯微鏡（蔡司，Axio Observer）、小動物磁共振成像儀（7T Bruker）。Triton X-100、正己醇、環(huán)己烷、四氫呋喃、二氯化錳、氯化亞鐵和鐵氰化鉀（艾覽化工科技）。CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)）。鈣黃綠素AM/PI 檢測試劑盒（活/死細(xì)胞染色試劑盒，凱基生物技術(shù)）。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、抗體（青霉素和鏈霉素）、胎牛血清、PBS 緩沖液、胰蛋白酶（Invitrogen Gibco）。除非另有說明，所有的試劑和溶劑均為購買獲得，未經(jīng)進(jìn)一步的純化而直接使用。實(shí)驗(yàn)中使用的水均為超純水。人源肝癌細(xì)胞（HepG2）由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室贈與。

1.2 Mn2+摻雜普魯士藍(lán)納米顆粒的合成及表征

1.2.1 Mn2+摻雜普魯士藍(lán)納米顆粒的合成 合成方法參考文獻(xiàn)［33］，將Triton X-100、正己醇和環(huán)己烷按質(zhì)量比2∶1∶1混合均勻，得到油相EAX。分別配制0.05 mol/L的MnCl2、FeCl2及鐵氰化鉀溶液各20 mL，再分別補(bǔ)充800 mg檸檬酸并超聲至澄清透明。

取8 g EAX和3.330 g鐵氰化鉀水溶液（0.05 mol/L）混合均勻，得到微乳液1。取8 g EAX，0.666 g MnCl2水溶液（0.05 mol/L），2.664 g FeCl2水溶液（0.05 mol/L）混合均勻，得到微乳液2。在磁力攪拌的條件下將微乳液1緩慢滴加到微乳液2中，室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后置于100 ℃水中水浴15 min破乳，然后離心、洗滌并干燥得到Mn2+摻雜普魯士藍(lán)納米顆粒Mn-PB NPs的粉末。

1.2.2 Mn-PB NPs理化性能檢測 配制濃度為60 μg/mL的Mn-PB NPs水分散系，通過布魯克海文NanoBrook 90PlusZeta型納米粒度電位儀測定粒徑及Zeta電位。取干燥后獲得的Mn-PB NPs粉末，通過Thermo Fisher Nicolet iS50 FT-IR 型傅里葉紅外光譜儀檢測Mn-PB NPs的紅外光譜圖。

1.2.3 光熱性能檢測 配制不同濃度（0、10、20、40、80 μg/mL）的Mn-PB NPs 水分散系，用808 nm 激光（2.5 W/cm2）分別照射10 min，通過Fluke TiS20 紅外熱像儀記錄過程的溫度變化數(shù)值。

配制濃度為40 μg/mL的Mn-PB NPs水分散系，測定不同功率密度（1.0、1.5、2.0和2.5 W/cm2）808 nm激光照射10 min的升溫?cái)?shù)值。

配制濃度為40 μg/mL的Mn-PB NPs水分散系，以808 nm激光（2.0 W/cm2）照射10 min，然后冷卻10 min為一個循環(huán)，反復(fù)循環(huán)4次，用Fluke TiS20 紅外熱像儀監(jiān)測并記錄其溫度變化。

1.2.4 紫外性能檢測 配制濃度為40 μg/mL的Mn-PB NPs水分散系，用Thermo Fisher Evolution 300型紫外-可見光吸收光譜儀測定光照前的紫外吸收曲線。用功率為2.0 W/cm2的808 nm NIR激光照射10 min，測定光照后的紫外吸收曲線。

1.2.5 T1-T2雙模磁共振成像效果檢測 配制濃度分別為320、160、80、40、20、10、0 μg/mL的Mn-PB NPs水分散系（PBS,pH=7.4），采用7T Bruker 小動物磁共振成像系統(tǒng)（Bruker Biospec,Billerica,MA）檢測其T1和T2成像性能。常規(guī)弛豫增強(qiáng)快速采集序列（RARE）采集T1w與T2w像，加速因子（RARE Factor）分別為2和16，TR/TE分別為500/4和2500/50 ms。T1-map采集序列為翻轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（IR），TR/TE=10000/30 ms，TI=10、20、40、80、120、200、500、1000、1600、2000、2500、3000、4000 ms。T2-map采集序列為多層多回波序列（MSME），TR/TE=2500/30 ms，TE=90、210、330、450、570、690、810、930、1050、1170、1290、1410、1530 ms。

1.3 腫瘤細(xì)胞光熱治療研究

按89%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素和鏈霉素）配制獲得DMEM完全培養(yǎng)基。用DMEM完全培養(yǎng)基對Mn-PB NPs進(jìn)行梯度稀釋，獲得材料濃度為0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL的工作液1。按DMEM完全培養(yǎng)基：CCK-8=10：1的比例配制獲得工作液2。取5 μLAM、5 μL PI及10 mL PBS混合并吹打均勻，獲得工作液3。用DMEM完全培養(yǎng)基對Mn-PB NPs 進(jìn)行梯度稀釋，獲得材料濃度為0、0.05、0.1、0.2 mg/mL的工作液4。

將HepG2細(xì)胞（1×104/孔）接種于96 孔板中孵育12 h，加入不同濃度的工作液1，共孵育4 h 后各孔用100 μL PBS潤洗3次，并補(bǔ)充100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，用808 nm激光（0.8 W/cm2）照射5 min，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2）繼續(xù)孵育8 h。采用標(biāo)準(zhǔn)的CCK-8 法計(jì)算光熱治療后的細(xì)胞存活率：各孔經(jīng)PBS潤洗后，加入100 μL工作液2，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育2 h，通過BIOTEKELX80型酶聯(lián)免疫分析儀測定各組的吸光度，細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算獲得。

將HepG2細(xì)胞（5×104/孔）接種于48 孔板中培養(yǎng)36 h。加入不同濃度的工作液4孵育4 h，PBS洗滌3次后各孔補(bǔ)充500 μL DMEM完全培養(yǎng)基，808 nm激光（0.8 W/cm2）照射5 min，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育8 h。根據(jù)鈣黃綠素AM/PI試劑盒的使用說明對細(xì)胞進(jìn)行處理：各孔經(jīng)PBS潤洗后補(bǔ)充500 μL工作液3，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育20 min，然后通過Axio Observer型倒置熒光顯微鏡對染色后的細(xì)胞進(jìn)行拍攝分析。（AM可將活細(xì)胞染成綠色，PI可將死細(xì)胞染成紅色。綠色熒光的激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為515 nm；紅色熒光的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為617 nm）

1.4 腫瘤細(xì)胞磁共振成像研究

用DMEM完全培養(yǎng)基對Mn-PB NPs進(jìn)行稀釋，獲得材料濃度為0.2 mg/mL的工作液5。將HepG2細(xì)胞（1×106/瓶）接種于T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)72 h。棄去原培養(yǎng)液，加入工作液5后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，PBS清洗3次后，加入1 mL胰蛋白酶消化80 s，然后加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞吹打下來后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中離心（800 r/min，3 min），獲得的細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)用于照片拍攝及細(xì)胞的磁共振成像。細(xì)胞的磁共振圖像來自于7TBruker小動物磁共振成像系統(tǒng)（Bruker Biospec,Billerica,MA），相關(guān)參數(shù)設(shè)置與測試Mn-PB NPs水分散系的磁共振成像參數(shù)一致。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組比較采用Two-way ANOVA，P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2 結(jié)果

2.1 Mn-PB NPs理化性能表征

Mn-PB NPs的粒徑為39.46±0.42 nm，分散性指數(shù)（PDI）為0.236，Zeta電位為-25.9±1.2 mV（圖1A）。Mn-PB NPs的紅外光譜圖顯示在2075.23 cm-1處存在很強(qiáng)的吸收尖峰（圖1B）。

圖1 (A)Mn-PB NPs在水中的粒徑分布.(B)Mn-PB NPs的紅外光譜圖Fig.1 Particle-size distribution of Mn-PB NPs in water(A)and its infrared spectra(B).

2.2 紫外吸收光譜和光熱表征

Mn-PB NPs 的紫外吸收最高峰位于713 nm，經(jīng)2.0 W/cm2的808 nm激光照射10 min后，紫外吸收曲線無明顯變化（圖2A）。同樣條件下，Mn-PB NPs水分散系的升溫曲線顯示，照射2 min后分散系溫度迅速上升到50.4 ℃，升溫幅度為20.4 ℃，該條件下超純水組水溫?zé)o明顯變化（圖2B）。保持Mn-PB NPs水分散系的濃度為40 μg/mL，用不同功率（1.0、1.5、2.0、2.5 W/cm2）的808 nm激光對分散系進(jìn)行10 min照射（圖2C），其升溫速率及最高穩(wěn)定溫度隨著Mn-PB NPs水分散系濃度的升高而提高。保持808 nm激光的功率為2.5 W/cm2，對不同濃度（0、10、20、40、80 μg/mL）的Mn-PB NPs分散系進(jìn)行10 min照射（圖2D），其升溫速率及最高穩(wěn)定溫度隨著激光功率的升高而提高。Mn-PB NPs分散系經(jīng)過4次激光照射/關(guān)閉循環(huán)（808 nm，2.0 W/cm2，10 min），各個循環(huán)中達(dá)到的最高溫度無顯著變化（圖2E）。

圖2 Mn-PB NPs的紫外吸收光譜和光熱效果圖Fig.2 UV-vis absorption(A)and photothermal effect(B)of Mn-PB NPs.C,D:Photothermal heating curves.E:Temperature variations of Mn-PB NPs.

2.3 磁共振成像效果測定

梯度濃度（0～1 mmol/L）Mn-PB NPs水分散系的T1及T2加權(quán)磁共振成像結(jié)果，隨著濃度的提高，磁共振成像的效果也逐漸提高（圖3A、B）。數(shù)據(jù)擬合獲得Mn-PB NPs水分散系的r1值為0.68（mmol/L）-1s-1，r2 值為3.65（mmol/L）-1s-1（圖3C、D）。

圖3 梯度濃度Mn-PB NPs的(A)縱向弛豫加權(quán)成像圖和(B)橫向弛豫加權(quán)成像圖，及其對應(yīng)的(C)縱向弛豫量化曲線及(D)橫向弛豫量化曲線Fig.3 T1-weighted (A) and T2-weighted (B) MR images acquired with different concentrations of Mn-PB NPs.C:Longitudinal relaxation rate quantization curve of aqueous dispersion of Mn-PB NPs.D:Transverse relaxation rate quantization curve of aqueous dispersion of Mn-PB NPs.

2.4 細(xì)胞的光熱治療

用不同濃度的Mn-PB NPs分散系與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，更換新鮮培養(yǎng)基后，以對照組為參考，控制光照的功率（0.8 W/cm2）和光照時間（5 min）一致。通過CCK-8法檢測各組對細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果表明在無激光照射的條件下，各濃度組的細(xì)胞存活率均接近90%。在激光照射下，細(xì)胞的相對存活率隨Mn-PB NPs分散系濃度的提高而降低，濃度為0.2 mg/mL的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率僅為10%左右（圖4A）。通過鈣黃綠素AM/PI試劑盒對不同濃度Mn-PB NPs的光熱治療效果進(jìn)行可視化測定，隨著共培養(yǎng)Mn-PB NPs的濃度提高，視野中綠色熒光數(shù)量減少，紅色熒光數(shù)量明顯增加（圖4B）。

圖4 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Fig.4 In vitro cell experiments.A:Cell viability of HepG2 cells treated with different concentrations of Mn-PB NPs before and after 808 nm NIR laser irradiation(0.8 W/cm2,5 min).(***P<0.001,**P<0.01).B:Fluorescence images of HepG2 cells irradiated with 808 nm NIR laser and stained by calcein AM/PI after treatment with different concentrations of Mn-PB NPs for 4 h(Scale bar=100 μm).

2.5 細(xì)胞的磁共振成像

用胰蛋白酶對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（與Mn-PB NPs共培養(yǎng)4 h）和對照細(xì)胞組（不給藥）進(jìn)行消化離心后獲得細(xì)胞沉淀。圖5A和B分別為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞沉淀、對照組細(xì)胞沉淀和PBS的T1w和T2w成像結(jié)果。圖5 C和D為與之對應(yīng)的量化T1值與T2值，從結(jié)果的均值來看，PBS的T1最長（2812.97 ms），空白細(xì)胞組次之（1832.12 ms），給藥細(xì)胞組最短（1126.31 ms），T2值也有著同樣的趨勢（349.89 ms、118.92 ms、45.19 ms）。圖5E為兩組細(xì)胞沉淀的對比照片。

圖5 經(jīng)Mn-PB NPs處理過的HepG2細(xì)胞的(A)T1加權(quán)成像、(B)T2加權(quán)成像效果和其對應(yīng)的(C)(D)量化柱狀圖，以及(E)離心所得細(xì)胞的對比照片F(xiàn)ig.5 T1-weighted(A) and T2-weighted(B)MR images and the corresponding quantized histograms(C,D) of HepG2 cells treated with Mn-PB NPs.E:A representative photograph of the cells obtained by centrifugation.***P<0.001,**P<0.01.

3 討論

Guillaume等［34］通過自組裝法合成了粒徑為63.0±8.7 nm的普魯士藍(lán)納米顆粒，Peng等［35］通過自蝕刻反應(yīng)獲得的普魯士藍(lán)納米顆粒的粒徑在100～200 nm范圍之間，Zhu 等［36］則通過NaCl 沉淀法獲得了粒徑在50～160 nm 范圍之間的普魯士藍(lán)。本研究通過Triton X-100微乳液體系制備的Mn-PB NPs粒徑僅為39.46±0.42 nm，PDI數(shù)值為0.236，表明納米顆粒粒徑較小且分布均勻，比以上方式合成普魯士藍(lán)的效果都要好。紅外譜圖中2075.23 cm-1處存在的吸收尖峰對應(yīng)著Mn-PB NPs結(jié)構(gòu)中的-C≡N-伸縮振動峰。Mn-PB NPs的紫外光譜圖最高吸收峰在713 nm，且在713～850 nm波長范圍內(nèi)仍具有較高吸收，表明材料具有成為光熱制劑的潛力。808 nm激光照射前后Mn-PB NPs分散系的顏色及紫外光譜圖無明顯變化，且經(jīng)4次激光照射/關(guān)閉循環(huán)后，分散系最高溫度均保持在72 ℃左右，表明Mn-PB NPs 具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力和優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性能。Mn-PB NPs的梯度激光功率和梯度濃度光熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Mn-PB NPs的光熱升溫效果對分散系的濃度及激光功率有依賴作用。相對于純水，Mn-PB NPs的T1w 是亮信號，T2w 是暗信號，且隨著Mn-PB NPs 濃度的增加，T1及T2的成像效果顯著提高。經(jīng)計(jì)算獲得Mn-PB NPs 的r1 值為0.68（mmol/L）-1s-1，r2 值為3.65（mmol/L）-1s-1，證明本研究合成的Mn-PB NPs具有優(yōu)異的磁共振成像效果。

鑒于Mn-PB NPs具有良好的磁共振增強(qiáng)效果和光熱轉(zhuǎn)換能力，我們對Mn-PB NPs進(jìn)行了細(xì)胞成像及光熱治療的研究。在無激光照射的條件下，CCK-8法各濃度組的細(xì)胞存活率均接近90%，表明Mn-PB NPs細(xì)胞毒性較低，具有良好的生物相容性。在激光照射下，CCK-8和鈣黃綠素AM/PI試劑盒檢測結(jié)果均顯示細(xì)胞的相對存活率隨Mn-PB NPs分散系濃度的升高而降低，說明該材料具有良好的光熱轉(zhuǎn)換能力及優(yōu)異的光熱治療效果。給藥前的細(xì)胞照片無明顯顏色，給藥后的細(xì)胞照片則出現(xiàn)了明顯的藍(lán)色，證明Mn-PB NPs可以成功被HepG2細(xì)胞胞吞。細(xì)胞磁共振成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胞吞了Mn-PB NPs的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞比對照組細(xì)胞具有更好的T1-T2雙模磁共振成像質(zhì)量，給藥組細(xì)胞量化的T1及T2值顯然低于未給藥組，進(jìn)一步表明了本研究合成的納米顆粒對HepG2細(xì)胞具有顯著的T1-T2雙模磁共振增強(qiáng)效果。

綜上，通過Triton X-100 微乳液體系制備的Mn-PB NPs具有良好的T1-T2雙模態(tài)磁共振成像和光熱治療效果，為開發(fā)新型診療一體化探針提供了新思路。但本研究合成的Mn-PB NPs探針尚未修飾靶向腫瘤基團(tuán)，也沒有在動物體內(nèi)開展相關(guān)的磁共振成像或光熱消融腫瘤實(shí)驗(yàn)，缺乏探針在體內(nèi)長效的穩(wěn)定性和安全性評估，這些將會在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)階段進(jìn)行相關(guān)探索研究。