秦 雪，李 琦，馮 瑞，趙 騫，鄭 鵬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

支持細(xì)胞（sertoli cell）是睪丸曲細(xì)精管內(nèi)唯一的體細(xì)胞，在生精過程中具有提供物理和代謝支持、穩(wěn)定微環(huán)境、釋放和分泌激素和營養(yǎng)物質(zhì)等多種功能［1－5］。為了研究睪丸支持細(xì)胞在特定條件下的反應(yīng)和功能，分離提純支持細(xì)胞并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白的支持細(xì)胞系是目前研究的重點(diǎn)。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein－N3 plasmid，pEGFP－N3）是一種用于檢測細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白定位的一種小分子蛋白，熒光強(qiáng)度高、不需反應(yīng)底物和輔助蛋白質(zhì)的修飾即可產(chǎn)生熒光，且對(duì)宿主細(xì)胞毒副作用小，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞可連續(xù)傳代，對(duì)受體的生長發(fā)育及功能等均無明顯影響［6－7］；蛋白序列也已經(jīng)明確可以在活細(xì)胞和生物體中對(duì)目的基因?qū)崟r(shí)示蹤和篩選［8－9］，在研究特定蛋白的定位、轉(zhuǎn)運(yùn)及其與宿主間的相互作用等方面均起著重要作用［10］。

試驗(yàn)分離純化犢牛睪丸支持細(xì)胞，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染和G418篩選，希望得到穩(wěn)定整合pEGFP－N3的支持細(xì)胞，為進(jìn)一步研究血睪屏障的形成和支持細(xì)胞的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和主要試劑

犢牛睪丸來源于雙城血清廠。犢牛屠宰放血后，立即無菌操作，割取睪丸，置于4℃生理鹽水中，3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

0.1%膠原酶，Sigma公司產(chǎn)品；0.25%胰酶，Amresco公司產(chǎn)品；基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM ＋10% 胎牛血清（FBS）＋1% 雙抗；DMEM、FBS，Gibco公司產(chǎn)品；雙抗（每毫升含10 000 U青霉素和10 mg鏈霉素），Biosharp公司產(chǎn)品；兔抗Vimentin多克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，Proteintech公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000、G418，Invitrogen公司產(chǎn)品；pEGFP－N3質(zhì)粒，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)家畜繁殖實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 犢牛睪丸支持細(xì)胞的分離純化

將收集的睪丸置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌，取睪丸實(shí)質(zhì)組織移入盛有PBS的玻璃皿中撥散，清洗，盡量去除血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞；將獲得的曲精細(xì)管移入離心管中，加入10倍體積的膠原酶消化液，室溫消化3～5 min，期間輕輕吹打2～3次，至曲細(xì)精管彼此分散開為止，加入5～10 mL PBS，輕輕吹勻后于600 r／min離心2～3 min，去除上清 液，重 復(fù) 上 述 消 化 5 ～10 min；然 后1 000 r／min離心5 min，去除上清液，獲得純凈的曲細(xì)精管；加入10倍體積的胰酶消化液，室溫消化3～5 min，期間輕輕吹打2～3次，待懸液中看不到微小的曲細(xì)精管片段時(shí)加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；用100μm和74μm篩網(wǎng)分別過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液以1 000 r／min離心5 min，去除上清液，將細(xì)胞沉淀重新以基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸起，獲得含有生精細(xì)胞和支持細(xì)胞兩種細(xì)胞的生精上皮細(xì)胞懸液。

將生精上皮細(xì)胞懸液調(diào)整密度為（1～5）×106個(gè)／mL，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4～6 h后支持細(xì)胞已大部分貼壁，用吸管輕輕吹打，懸起尚未緊密貼壁的生精細(xì)胞和部分支持細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，添加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用PBS清洗2次，用胰酶消化細(xì)胞后重新接種培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光染色

待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用4%多聚甲醛固定15 min，用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS清洗2次，每次5 min，滴加5% BSA封閉液室溫封閉40 min，棄掉封閉液，加1∶500倍稀釋（含1%BSA的PBS溶液）的兔抗Vimentin多克隆抗體，4℃孵育過夜，使用正常的IgG作為陰性對(duì)照。用含0.1% BSA 的PBS溶液清洗2次，每次5 min，加入1∶100稀釋（含1% BSA的PBS溶液）的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫避光孵育1 h，再用含0.1% BSA的PBS溶液清洗2次，每次5 min，然后用DAPI復(fù)染5 min。PBS清洗3次后，在熒光顯微鏡下觀察和照相。

1.4 轉(zhuǎn)染pEGFP－N3載體

轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞種植在6孔板中。待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用無血清的DMEM沖洗細(xì)胞，再加入無血清的DMEM 2 mL。取Lipofectamine 2000 3μL和pEGFP－N3重組質(zhì)粒（使用Omega公司的無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取后使用）1μg，分別加入100μL無血清的DMEM 混合均勻，室溫孵育5 min；輕輕混合上述兩種混合物，室溫孵育20 min；均勻吸取混合物緩慢加入6孔板中，37℃、5% CO2孵育細(xì)胞6 h，再換成正常培養(yǎng)液；細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白基因的表達(dá)情況；小心將細(xì)胞消化下來，以1∶5的比例稀釋，接種到6孔板中過夜培養(yǎng)；第2天待細(xì)胞貼壁表達(dá)蛋白后，以確定好的篩選濃度加入500μg／mL G418，輕柔混勻，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基。1周后未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大量死亡，更換維持濃度200μg／mL的G418培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 犢牛睪丸支持細(xì)胞的分離純化與鑒定

采用剝離和胰酶消化首先獲得曲細(xì)精管，然后采用膠原酶法進(jìn)行消化，獲得支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的混合細(xì)胞；之后差速貼壁培養(yǎng)，獲得較純潔的支持細(xì)胞；更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，獲得原代支持細(xì)胞，見圖1。支持細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，支持細(xì)胞的純度達(dá)到95%以上，見圖2。

圖1 犢牛睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)（Bar＝50μm）

圖2 犢牛睪丸支持細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定（Bar＝50μm）

2.2 犢牛睪丸支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞以1∶5的比例傳代到新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；第2天加入篩選劑量的G418。1周后未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大量死亡，剩余的為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群，見圖3；更換含維持劑量G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2周后得到穩(wěn)定整合有外源基因的支持細(xì)胞克隆，見圖4。

圖3 G418篩選1周的犢牛睪丸支持細(xì)胞（Bar＝50μm）

圖4 G418篩選2周的犢牛睪丸支持細(xì)胞（Bar＝100μm）

3 討論

隨著對(duì)睪丸支持細(xì)胞生物學(xué)特性研究的逐漸深入，支持細(xì)胞的分離方法和程序要求既要操作簡單還要適合在無菌條件下進(jìn)行。本試驗(yàn)利用膠原酶和胰酶兩種組合酶前后分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，根據(jù)支持細(xì)胞和精原細(xì)胞生長速度和貼壁時(shí)間不一致的特點(diǎn)分離純化支持細(xì)胞。在培養(yǎng)4～6 h后將未貼壁的精原細(xì)胞去除，從而得到生長狀態(tài)良好、較為純化的犢牛睪丸支持細(xì)胞。由于簡化了犢牛睪丸支持細(xì)胞的分離和純化步驟，最大限度地避免了睪丸中其他體細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的污染。

目前細(xì)胞轉(zhuǎn)染系統(tǒng)主要有兩大類型，一類是基因整合并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，另一類是不產(chǎn)生基因整合的短暫轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染使用的方法有很多，如化學(xué)轉(zhuǎn)染法（DEAE葡聚糖法和人工脂質(zhì)體法等）、物理轉(zhuǎn)染法（電穿孔法和基因槍法等）和病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法［11－12］。每種轉(zhuǎn)染方法都有各自的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染效率也不一致，根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)以及試驗(yàn)實(shí)際情況可以自行選擇。犢牛睪丸支持細(xì)胞是研究雄性動(dòng)物血睪屏障的一個(gè)良好的研究體系。本試驗(yàn)利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pEGFPN3載體，轉(zhuǎn)染48 h后EGFP蛋白仍在細(xì)胞中均勻表達(dá)，通過G418篩選后得到穩(wěn)定整合有外源基因的犢牛睪丸支持細(xì)胞克隆。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率低是一個(gè)常見問題，這與細(xì)胞的生長特性和轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)有密切聯(lián)系。因此，在轉(zhuǎn)染中為了提高轉(zhuǎn)染效率，選擇了處于對(duì)數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的睪丸支持細(xì)胞，盡可能減少細(xì)胞暴露時(shí)間，還要選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行轉(zhuǎn)染；其次EGFP蛋白在未正確折疊時(shí)也不會(huì)觀察到熒光，且相對(duì)分子質(zhì)量大小的改變可能會(huì)影響EGFP生色基團(tuán)的形成和EGFP的功能，這可能是轉(zhuǎn)染后少數(shù)細(xì)胞中沒有觀察到綠色熒光的原因之一。在今后的研究中，可根據(jù)上述影響外源基因轉(zhuǎn)染效率的參數(shù)來進(jìn)一步優(yōu)化pEGFP－N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犢牛睪丸支持細(xì)胞的條件。

本試驗(yàn)通過在犢牛睪丸支持細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP－N3載體，經(jīng)過G418篩選后，初步建立了能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞系。然而這種原代細(xì)胞隨著篩選次代的增多，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)衰老的特征，因此需要根據(jù)細(xì)胞自身的特質(zhì)在合適的代次中開展研究，本試驗(yàn)成果將為目標(biāo)蛋白質(zhì)在犢牛睪丸支持細(xì)胞中的功能研究提供理論依據(jù)。