韓 奕，張 林，侯令欣，張鴻露，景文娟，溫詔禹，張 杰，尉俊嶺，莫顯紅

（赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，人們對(duì)生活品質(zhì)的追求不斷提高。其中豬、牛、羊肉作為日常生活中肉類(lèi)食品的主要來(lái)源，需求量不斷增加，同時(shí)對(duì)其品質(zhì)的要求也在提高。目前在家畜育種繁殖過(guò)程中仍然存在很多問(wèn)題，如家畜精子品質(zhì)差、存活率低，導(dǎo)致受精率低，甚至出現(xiàn)不育的現(xiàn)象，這是目前亟待解決的問(wèn)題［1－3］。精子從發(fā)生到成熟的過(guò)程中，如果受到周?chē)h(huán)境、生殖毒性以及機(jī)體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂等因素的影響，會(huì)引起精子質(zhì)量下降、繁殖性能受損［4－5］；精漿中抗氧化酶活性不足是導(dǎo)致男性不育的主要原因［6－8］；此外，精液保存過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，是導(dǎo)致精子損傷及受精能力下降的重要原因之一［9－10］。

維生素E是機(jī)體所必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，但它在體內(nèi)不能自主合成，必須從相應(yīng)的食物或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑中才能獲得。相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果證明，維生素E具有抗氧化活性，在生殖方面具有積極作用：它能夠提高家畜生殖器官發(fā)育、精子活率以及精子品質(zhì)，降低精子畸形率，從而提高生育能力［2－3］；維生素E還可以防御輻射所致的氧化損傷，保護(hù)精細(xì)胞、卵細(xì)胞、肺部細(xì)胞、血紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜的完整性［11－12］。

本試驗(yàn)以昆明小白鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，探討如何在體內(nèi)對(duì)精子形成有效的保護(hù)。迄今為止，飼喂維生素E軟膠囊對(duì)小鼠精液品質(zhì)的影響及適宜濃度范圍的研究較少。本試驗(yàn)主要通過(guò)檢測(cè)精子活力、精子密度，綜合評(píng)價(jià)維生素E對(duì)精子特性的影響；并將各組精液與卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，通過(guò)統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率評(píng)價(jià)維生素E對(duì)精子體外受精能力的影響，綜合分析維生素E對(duì)改善小鼠精子品質(zhì)和受精能力之間的相關(guān)性，以期為家畜動(dòng)物育種生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明白系3～4周齡雄性小鼠、7～8周齡成熟雌性小白鼠各36只，購(gòu)自斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及操作液

試驗(yàn)所用試劑除特別說(shuō)明外，均為Sigma公司產(chǎn)品。

1）M2液的配制。稱取NaCl 2.767 g，KCl 0.178 g，KH2PO40.081 g，NaHCO30.168g，MgSO4（單溶）0.147 g，CaCl2（單溶）0.125 g，乳酸鈉1.660 mL，葡萄糖0.500 g，丙酮酸鈉0.011 g，谷氨酰胺0.073 g，青霉素G 0.030 g，加水混勻定容至500 mL，使用一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾后放于冰箱4℃儲(chǔ)存。使用前取適量液體加入3 mg／mL牛血清白蛋白（BSA），現(xiàn)用現(xiàn)配。

2）精子獲能液和受精液。人類(lèi)輸卵管液（HTF液，M1130，購(gòu)自南京愛(ài)貝生物科技有限公司），專為受精過(guò)程中精子和卵母細(xì)胞提供適宜的環(huán)境。該培養(yǎng)液采用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)，為促進(jìn)卵母細(xì)胞和精子細(xì)胞進(jìn)行有效的新陳代謝創(chuàng)建富含葡萄糖的環(huán)境。適用于在5% CO2環(huán)境中進(jìn)行短時(shí)間或長(zhǎng)時(shí)間受精操作。

3）胚胎培養(yǎng)液。小鼠胚胎培養(yǎng)液（KSOM液，Merck Millipore公司產(chǎn)品），包含低濃度NaCl、KCl、乳酸鹽和葡萄糖，用于體外受精早期胚胎培養(yǎng)，支持各種品系小鼠的早期胚胎發(fā)育。

2 方法

2.1 小鼠的分組及飼養(yǎng)管理

選取3～4周齡健康雄性小鼠36只，隨機(jī)分對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組6只，對(duì)照組和試驗(yàn)1，2，3，4，5組分別灌服維生素E 0，20，40，60，80，100 mg／d，共處理30 d，每隔7 d測(cè)量1次體重并記錄。試驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于控光條件下（光照14 h，05：00—19：00），自由采食和飲水［13］。

2.2 維生素E劑量的換算

已知維生素E軟膠囊400 mg／粒，每瓶100粒，每粒含維生素E 100.0 mg。

單位換算：m＝ρV。式中：m為質(zhì)量，ρ為密度，V為體積。

ρ（維生素E）＝0.94 g／mL，則對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組飼喂維生素E的劑量分別為0，21，43，64，86，106μL。

2.3 精液的獲取

飼養(yǎng)30 d后，采用頸部脫臼法處死小鼠，用剪刀剪取附睪和附睪尾，稱重。隨后在潔凈無(wú)菌條件下將附睪尾剪3～4個(gè)切口，放入預(yù)先平衡的HTF液中，于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中獲能1.0～1.5 h。獲能處理后的精子用于檢測(cè)精子活力和精子密度，或用于體外受精。

2.4 精子密度與精子活力的測(cè)定

精子處理后直接送赤峰市婦產(chǎn)醫(yī)院生殖中心檢測(cè)精子活力和精子密度。

2.5 卵母細(xì)胞的獲取方法

選用7～8周齡雌性小鼠36只，購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG，購(gòu)自寧波第二激素廠）7.5 IU／只，48 h后注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，購(gòu)自寧波第二激素廠）7.5 IU／只。hCG注射14～16 h后，采用頸部脫臼法處死小鼠，解剖，獲得輸卵管壺腹部（見(jiàn)圖1），于M2操作液中用1 mL注射器輕輕劃開(kāi)，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs，見(jiàn)圖2）。將COCs移入0.1%（W／V）的透明質(zhì)酸酶中消化，脫去卵丘顆粒細(xì)胞，在體視顯微鏡下收集形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻、有第一極體排出的卵母細(xì)胞供體外受精試驗(yàn)用［14］。

圖1 小鼠輸卵管壺腹部

圖2 小鼠卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體

2.6 體外受精及早期胚胎培養(yǎng)

吸取適量已獲能的精子懸浮液加入含有卵母細(xì)胞的HTF微滴中。精卵結(jié)合4～6 h后，洗去多余精子，移入KSOM液微滴中發(fā)育。24 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，96 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率。

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)中除體重變化采用“平均數(shù)”表示外，其余指標(biāo)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 平均體重變化

見(jiàn)表1。

由表1可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1，2，3，4，5組小鼠各階段平均體重均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明脂溶性維生素E不會(huì)引起肥胖，從而影響精子質(zhì)量。

表1 各組雄性小鼠體重測(cè)定結(jié)果 g

3.2 睪丸和附睪尾重量

見(jiàn)表2。

由表2可知，試驗(yàn)1，2，3，4，5組小鼠睪丸和附睪尾重量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組雄性小鼠睪丸和附睪尾重量測(cè)定結(jié)果g

3.3 精子品質(zhì)

見(jiàn)表3。

由表3可知，試驗(yàn)2，3組精子活力、精子密度顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05），試驗(yàn)1，4，5組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組雄性小鼠精子活力和密度測(cè)定結(jié)果

3.4 精子受精能力

見(jiàn)表4。

表4 各組精子受精能力測(cè)定結(jié)果

由表4可知：經(jīng)過(guò)體外受精，卵裂率各組之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)2，3組囊胚率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），試驗(yàn)1，4，5組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

4 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，雄性小鼠飼喂維生素E可有效提高精子質(zhì)量。維生素E 劑量為40～60 mg／d的試驗(yàn)2，3組精子密度、精子活力均顯著高于對(duì)照組；而維生素E劑量再增加，精子密度、精子活力則呈下降趨勢(shì)。在體外受精試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，維生素E劑量為40～60 mg／d的試驗(yàn)2，3組受精后卵裂率與對(duì)照組和其他試驗(yàn)組無(wú)顯著差異，但囊胚率顯著高于對(duì)照組?？梢?jiàn)，精子活力、精子密度與受精能力息息相關(guān)。

維生素E為機(jī)體內(nèi)重要的微量營(yíng)養(yǎng)素，又稱生育酚，具有抗氧化活性，可有效阻止活性氧化物的形成，改善精液品質(zhì)。2018年，曲揚(yáng)華［2］在維生素E對(duì)綿羊精子發(fā)生的影響機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，維生素E可通過(guò)提高綿羊睪丸細(xì)胞活力，參與調(diào)控綿羊生精過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)精子發(fā)生。然而，高劑量維生素E又會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞數(shù)量減少與凋亡增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即灌服高濃度（80～100 mg／d）維生素E的試驗(yàn)4，5組精子活力、精子密度低于灌服40～60 mg／d維生素E的試驗(yàn)2，3組。其影響機(jī)制可能與血清甲狀腺激素（T4）水平下降與激素受體基因表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)；還可通過(guò)睪丸細(xì)胞內(nèi)TGF－β信號(hào)通路下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)組分膠原蛋白的基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)含量減少，從而影響精子發(fā)生。

精子損傷還包括DNA斷裂，這會(huì)導(dǎo)致受精后胎兒畸形或形成死胎，引起流產(chǎn)或無(wú)法受孕［10，15］。本試驗(yàn)中飼喂40 ～60 mg／d維生素E的試驗(yàn)2，3組體外受精后囊胚率顯著高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)樵诰影l(fā)生過(guò)程中，維生素E通過(guò)提高過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，抵抗氧化應(yīng)激，有效保持了精子DNA的完整性［9］。

本試驗(yàn)采用不同濃度的維生素E飼喂雄性小鼠，飼喂40～60 mg／d范圍對(duì)小鼠精子密度、精子活力及提高體外受精能力具有積極作用。維生素E發(fā)生作用的濃度存在物種差異，小鼠與豬、羊等動(dòng)物的有效劑量不同；另外維生素E的劑型對(duì)動(dòng)物有效作用也是有影響的，本試驗(yàn)中所用的維生素E為油狀軟膠丸，純度與粉末狀維生素E存在差異。

5 結(jié)論

灌服維生素E 40～60 mg／d可有效提高小鼠精子活力和精子密度，對(duì)小鼠精子的保護(hù)作用較好，同時(shí)也提高了體外受精效果。