馬曉華 胡青荻 張慶良 錢仁卷 劉洪見 張旭樂

（浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis），蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物，生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有70 多個原生種，是觀賞價值極高的一種附生蘭，因其花色絢麗、花型奇特、姿態(tài)優(yōu)美，素有‘洋蘭皇后’的美譽[1-2]。目前，蝴蝶蘭是國內(nèi)外年宵花市場上最受廣大消費者喜愛的中高檔盆花之一，市場需求量逐年遞增。蝴蝶蘭為熱帶花卉，喜溫暖濕潤的環(huán)境，尤其對溫度十分敏感，最適宜的生長溫度約為18～28 ℃，當環(huán)境溫度低于10 ℃會停止生長，低于5 ℃，根系停止吸水，出現(xiàn)凍傷，植株容易死亡[3]。當前溫度已成為限制蝴蝶蘭生產(chǎn)且影響其花卉品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一，嚴重制約了蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。因此，探索不同的蝴蝶蘭品種在低溫條件下的生理生化響應，篩選耐低溫型的蝴蝶蘭品種一直是國內(nèi)外學者的研究重點之一。

大量研究表明，植物在長期的進化過程中，形成了相關的抗氧化酶保護系統(tǒng)以調(diào)節(jié)逆境脅迫所帶來的不利反應，但不同的植物種屬間由于遺傳特性不同，對環(huán)境的適應調(diào)節(jié)能力存在顯著差異，即使是同種屬的不同品種也會因選育方向、遺傳背景等原因表現(xiàn)出完全不同的環(huán)境適應能力[4]。近年來，隨著蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蝴蝶蘭屬至少包含35 種以上，并且還存在著極多的種間和屬間的雜交種[5]，由此表明，蝴蝶蘭的遺傳基礎復雜多樣，不同品種間極可能存在著巨大的抗性差異。劉學慶等[6]研究探索了6 個蝴蝶蘭品種的耐低溫能力，發(fā)現(xiàn)大部分蝴蝶蘭品種的極限耐受夜溫低于9 ℃。高冬冬等[7]研究了3 個蝴蝶蘭品種在低溫0 ℃和5 ℃條件下48 h 內(nèi)葉片的生理響應，表明0 ℃/12 h 可能是蝴蝶蘭耐冷性品種的低溫承受極限，但還需要結(jié)合實際進行更深入的探索。田丹青等[5]通過對3 個蝴蝶蘭品種的抗寒性分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和丙二醛（MDA）含量與蝴蝶蘭的抗寒性關聯(lián)度較高，可以作為蝴蝶蘭抗寒性的鑒定指標。目前0～5 ℃的低溫是長江中下游地區(qū)在蝴蝶蘭的冬季生產(chǎn)過程中限制花卉品質(zhì)和觀賞價值的重要環(huán)境條件之一，而關于蝴蝶蘭品種在極端低溫條件下短期的生理生化變化研究較少，大多數(shù)集中在4 ℃或5 ℃條件下蝴蝶蘭在0～12 h 內(nèi)的生理響應或不同濃度水楊酸（SA）對蝴蝶蘭抗冷性的影響[7-8]。

‘綠熊’和‘安娜’是該地區(qū)市場的主推品種及低溫型蝴蝶蘭育種的重要材料之一，而關于‘綠熊’和‘安娜’的相關研究卻未見報道。因而本試驗選用‘綠熊’和‘安娜’2 個蝴蝶蘭品種，主要研究其在5 ℃極端低溫條件下的生長變化和生理響應，探索不同的蝴蝶蘭品種在極端低溫條件下的適應能力，以期為蝴蝶蘭抗寒性品種的選育和栽培管理提供一定的試驗素材和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年11—12 月，在浙江杭州的浙江省農(nóng)業(yè)科學院低溫控制室內(nèi)（118?21′～120?30′E，29?11′～30?33′N）進行。供試材料為蝴蝶蘭‘綠熊’和‘安娜’。自2017 年至2019年栽培，期間以智利進口水草為基質(zhì)，精細水肥管理。試驗選擇長勢良好，葉片4～5 片，健康無病蟲害的2 年生正常生長的植株。

1.2 試驗設計

首先將供試的蝴蝶蘭植株置于晝（25 ℃）/夜（18 ℃）、光照晝（180 μmol/(m2·s)；12 h）/夜（0 μmol/(m2·s)；12 h）、相對濕度（RH）70%～75%的41H02 培養(yǎng)箱（PERCIVALE，美國）內(nèi)預處理5 d，并保證基質(zhì)等其他條件滿足植物的生長需求，使各植株生長一致。預處理結(jié)束后將各植株放入溫度為5 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，RH 70%～75%，光照設置與預處理相同，分別在0（CK）、12、24、48 h 取各植株葉片進行生理指標分析。低溫處理結(jié)束后放置在正常的氣候室內(nèi)進行恢復生長，期間每天觀察植株的表觀變化至冷害癥狀顯著。

1.3 試驗方法

試驗處理結(jié)束后，采用Li?6400（LI?COR，美國）便攜式光合儀在開放氣路下測定不同處理的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）。由于蝴蝶蘭為景天酸代謝途徑植物，氣孔夜間開放，在22：00—24：00，設光合有效輻射0 μmol/(m2·s)，流速500 mol/s，葉室溫度與培養(yǎng)溫度相同，CO2濃度400 μmol·mol。蝴蝶蘭葉片酶液提取，pH=7.5預冷的磷酸緩沖液（0.05 mmol/L），加入0.5 g 葉片樣品冰浴研磨成勻漿，4 ℃下8000 rpm 離心20 min，取上清液備用。SOD 活性測定采用SOD試劑盒（南京建成生物公司，中國），愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性[9]，紫外吸收法測定CAT 活性[10]，細胞膜透性測定采用電導法[11]，MDA 含量測定采用硫代巴比妥法[10]，葉綠素含量測定采用乙醇浸提法[12]。蒽酮比色法測定植株的可溶性糖[12]，考馬斯亮藍染色法測定植株的可溶性蛋白[13]，脯氨酸采用磺基水楊酸和茚三酮的方法測定[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計處理，運用Duncan 檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對2 個蝴蝶蘭品種表型的影響

葉片是植物營養(yǎng)儲存和轉(zhuǎn)化的重要部位，也是植物進行光合作用的主要器官，其生長狀況直接影響植物的光合作用效率，進而影響植株整體的生長和發(fā)育狀態(tài)[14]。由圖1 可知，低溫脅迫后正常條件恢復生長4 d，2 個蝴蝶蘭品種的冷害癥狀差異十分明顯。與CK 相比，‘安娜’的冷害表現(xiàn)較為嚴重，‘綠熊’的冷害表現(xiàn)十分輕微。具體癥狀為‘安娜’在低溫脅迫48 h 后，恢復生長1 d 老葉表現(xiàn)出輕微冷害癥狀，葉尖稍有凍斑；2 d 新葉出現(xiàn)凍斑，老葉萎蔫；3 d 新葉出現(xiàn)凍斑更加嚴重，老葉萎蔫；4 d 新葉出現(xiàn)凍斑加劇，老葉萎蔫脫落?！G熊’經(jīng)過48 h 低溫脅迫，在正常條件下恢復生長4 d 后，沒有明顯的冷害癥狀，只有部分老葉有極其輕微凍斑，部分葉片褪綠發(fā)黃。

圖1 低溫脅迫（5 ℃低溫處理48 h，恢復生長4 d）對蝴蝶蘭葉片表型的影響Fig.1 The effect of cold stress (5 ℃ cold stress 48 h,recovery growth 4 d) on the leaf morphology of P.amabilis

2.2 低溫對2 個蝴蝶蘭品種光合參數(shù)的影響

光合作用是植物物質(zhì)和能量代謝的基礎，蝴蝶蘭作為景天酸代謝途徑的植物，其光合作用在低溫條件下的變化見表1。在低溫條件下，‘綠熊’與‘安娜’2 個蝴蝶蘭品種的Pn、Gs、Ci和Tr均隨溫度處理時間的增加呈下降趨勢（P<0.05）?！G熊’葉片的Pn、Gs在低溫處理0、12、24 h 差異不顯著，但在處理48 h 時含量最低（P<0.05）?！G熊’葉片的Ci和Tr隨著低溫時間的增加而逐漸降低，且在處理48 h 達最?。≒<0.05）?！材取腜n、Gs、Ci和Tr與隨著低溫處理時間的增加呈顯著降低趨勢，且下降幅度顯著大于‘綠熊’（P<0.05），并在低溫處理48 h 時含量達到最低，分別是0 h 的72.8%（P<0.05）、66.67%（P<0.05 ）、78.52%（P<0.05）和81.7%（P<0.05）。

表1 低溫脅迫對2 個蝴蝶蘭品種光合參數(shù)的影響Table 1 The effect of cold stress on the photosynthetic parameter of 2 cultivars of P.amabilis

2.3 低溫對2 個蝴蝶蘭品種相對電導率與MDA 含量的影響

相對電導率（REC）是細胞膜透性的重要體現(xiàn)，MDA 是植物細胞膜脂過氧化的終產(chǎn)物，因而二者常被當作了解逆境對生物膜傷害程度的重要指標[15]。由圖2 可知，在低溫脅迫條件下，‘綠熊’與‘安娜’蝴蝶蘭的REC 與MDA 含量均隨處理時間的增加呈上升的趨勢（P<0.05）。‘綠熊’葉片的REC 在低溫處理0、12、24 h 差異不顯著，但在處理48 h 時達最大值，顯著高于低溫0 h 的REC 值（P<0.05）；MDA 含量在低溫處理24 h 和48 h 差異不顯著，但在處理48 h 時為最大顯著高于其他時間處理，是0 h 的106.41%（P<0.05）?！材取~片的REC 和MDA 含量，隨著低溫處理時間的增加呈顯著上升趨勢，并在處理時間至48 h 達最大值（P<0.05），且上升幅度明顯高于‘綠熊’。

圖2 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片REC 與MDA含量的影響Fig.2 The effect of cold stress on the REC and MDA content in the leaves of P.amabilis

2.4 低溫對2 個蝴蝶蘭品種抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT 和POD 是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，會及時清除過剩的活性氧使其在植物體內(nèi)維持一個動態(tài)平衡[16]。由圖3 可知，低溫脅迫顯著增強了‘綠熊’與‘安娜’葉片的POD、CAT、SOD 活性，并隨著處理時間延長上升趨勢十分顯著（P<0.05）。隨著低溫時間的增加，‘綠熊’葉片的POD 酶活性逐漸上升，但在在處理12 h和24 h 差異不顯著，低溫處理48 h 時達最大值；‘綠熊’葉片的CAT 和SOD 酶活性隨著處理時間的延長呈上升趨勢十分顯著（P<0.05），并且在48 h 時達最大值，且顯著高于在相同處理時間的‘安娜’葉片的CAT、SOD 酶活性（P<0.05）。‘安娜’葉片的POD、CAT、SOD 酶活性隨低溫時間的增加而顯著升高（P<0.05），并在低溫處理至48 h 時達最大值；但CAT 酶活性在處理24 h和48 h 時差異不顯著。

圖3 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片POD、CAT 和SOD 活性的影響Fig.3 The effect of cold stress on the POD,CAT and SOD enzyme activity in the leaves of P.amabilis

2.5 低溫對2 個蝴蝶蘭對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖4 可知，低溫脅迫顯著增加了‘綠熊’葉片可溶性糖和可溶性蛋白的含量，且顯著高于相同條件下的‘安娜’葉片的含量，并隨著處理時間的增加呈顯著上升的趨勢（P<0.05）?！G熊’葉片的可溶性糖含量在處理時間24 h 和48 h時差異不顯著，但顯著高于0 h（P<0.05），分別是0 h 的135.8%和136.1%?！G熊’葉片的脯氨酸含量也隨著處理時間的增加逐漸上升，但顯著低于‘安娜’葉片在相同處理時間的脯氨酸含量（P<0.05）?！材取目扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍缀侩S著處理時間的延長增加趨勢緩慢；且可溶性糖在處理時間為12、24、48 h 時差異不顯著；可溶性蛋白在處理時間24 h 和48 h 時差異不顯著，但顯著高于0 h（P<0.05）?！材取~片的脯氨酸含量隨著處理時間的延長呈顯著上升的趨勢（P<0.05），在處理時間48 h 時達最大，是對照組的204.04%。

圖4 低溫脅迫對蝴蝶蘭葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.4 The effect of cold stress on the content of soluble sugar,soluble protein and proline in the leaves of P.amabilis

3 結(jié)論與討論

蝴蝶蘭是目前花卉市場上最受廣大消費者喜愛的年銷花之一，低溫是影響其觀賞期及品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一，且隨著蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，大量的新品種不斷產(chǎn)生，而關于新品種的低溫耐受力并未有明確的標準和界定。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃的低溫脅迫顯著影響了蝴蝶蘭品種‘綠熊’和‘安娜’的葉片形態(tài)，二者均出現(xiàn)了不同的凍害癥狀。‘安娜’主要表現(xiàn)為葉片發(fā)軟，并出現(xiàn)大量水漬狀凍斑；而‘綠熊’只是部分葉片出現(xiàn)了褪綠條紋和極其輕微的小點凍斑，整體葉片硬度也比‘安娜’要高，這與高冬冬等的研究相似[7]。表明‘綠熊’品種葉片的低溫耐受力要優(yōu)于‘安娜’，說明‘綠熊’蝴蝶蘭在低溫脅迫下會通過引發(fā)一系列生理生化的反應以保持良好健康的葉片形態(tài)來緩解極端低溫對其造成的傷害。

光合作用制造有機物并提供其他生命活動所需能量，是植物生長發(fā)育的基礎，而光合參數(shù)直觀地體現(xiàn)了植物的光合作用水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫脅迫顯著降低了‘綠熊’和‘安娜’的Pn、Gs、Ci和Tr，并隨著低溫時間的延長而逐漸降低。但在處理時間12 h 和24 h 時，‘綠熊’的Pn和Gs與其CK 差異不顯著，表明5 ℃低溫處理24 h 對‘綠熊’所造成的傷害可以通過其自身的生理生化反應緩解并抵消。而當處理時間延長至48 h 時，‘綠熊’和‘安娜’的Pn、Gs、Tr和Ci均顯著低CK，表明二者此時的Pn均受到了氣孔因素的限制。而且因為‘安娜’的Ci在5 ℃低溫處理24 h 和48 h 時差異不顯著，且‘安娜’Pn的下降幅度遠高于‘綠熊’，表明此時‘安娜’蝴蝶蘭的Pn可能不僅受到了氣孔因素的限制，而且還包含非氣孔因素的影響，與郝平安對其品種他蝴蝶蘭研究結(jié)果相似，表明此時極端低溫已經(jīng)對安娜的光合器官和光合系統(tǒng)等造成了損傷[18]。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應逆境的重要生理機制，其主要依賴植物細胞的滲透膜，因而植物細胞膜的透性和完整性也是植物耐低溫能力的一個重要體現(xiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫顯著增加了‘綠熊’和‘安娜’葉片的REC 和MDA 含量，并隨著低溫時間的延長而顯著增加，與郝平安[18]在其他蝴蝶蘭品種的研究相似，表明2 種蝴蝶蘭在低溫條件下通過調(diào)節(jié)生物膜的滲透性維持細胞膨壓，促使其在低溫脅迫時保持細胞內(nèi)的生理生化活動正常進行。而‘安娜’葉片MDA 含量在5 ℃處理48 h 時的顯著增加也表明此時其葉片的生物膜受到了低溫損傷，并發(fā)生了膜脂過氧化現(xiàn)象。植物在逆境條件下會產(chǎn)生大量活性氧（ROS），直接或間接地對植物細胞造成氧化傷害，本研究中，‘綠熊’和‘安娜’葉片SOD、CAT 和POD活性隨著5 ℃低溫處理時間的延長顯著增加，說明二種蝴蝶蘭均通過增強SOD、CAT 和POD的抗氧化酶以清除低溫脅迫引起的過?；钚匝?，避免活性氧堆積造成的氧化損傷，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，與楊為海等的研究結(jié)果一致[20]。

脯氨酸在植物體內(nèi)經(jīng)常作為活性氧的清除劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用[21]。5 ℃處理顯著增加了‘綠熊’和‘安娜’體內(nèi)的脯氨酸含量，并隨著處理時間的延長顯著增加，可能是葉片在低溫脅迫過程中通過增加脯氨酸的含量防止組織脫水，緩解低溫對植株造成的傷害?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴呛康纳咭矠橹参餄B透調(diào)節(jié)提供物質(zhì)和能量基礎，幫助植物抵御低溫傷害[22]。隨著低溫時間的增加，‘綠熊’的可溶性糖和可溶性蛋白積累量顯著升高，并大幅度高于‘安娜’，表明‘綠熊’進行了蛋白質(zhì)小分子的合成和糖分的積累以助于植株抵御低溫傷害，也是‘綠熊’的低溫抵抗力優(yōu)于‘安娜’的另一重要體現(xiàn)。