何彥儀 羅雨薇 許美瀅 竺永金 鄭紅宇 胡世俊 閆曉慧

（1.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學林學院，西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650233）

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophtora infestans）引起、對馬鈴薯（Solanum tuberosum）具有毀滅性的疾病[1]。馬鈴薯晚疫病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播、危害大、難防控，已經(jīng)超過水稻稻瘟病和小麥銹病，被視為國際第1 大作物病害[2-3]。馬鈴薯晚疫病的防治措施均以化學防治為主，輔以簡易的生物防治與物理防治?；瘜W農(nóng)藥的使用次數(shù)和劑量的增加在一定程度上促使致病菌株產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染與農(nóng)藥殘留等問題，導致防治效果降低[4]。植物源農(nóng)藥具有對生態(tài)環(huán)境安全、非靶標生物影響較小、原材料來源廣泛等優(yōu)點，因此從植物中尋找新的殺菌抑菌活性物質(zhì)、研制開發(fā)新型植物源農(nóng)藥是當下的熱點[5]。

牛尾蒿（Artemisia dubia）隸屬菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia），為中國特有種，生于海拔3500 m 以下的山坡、草原、疏林及林緣地，主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南、西藏等省份[6]。研究表明，蒿屬植物及其活性化合物被認為具有抗瘧、抗氧化、驅(qū)蟲、神經(jīng)保護、抗炎和抗微生物等作用[7]。牛尾蒿為我國傳統(tǒng)藏藥，可作牲畜飼養(yǎng)材料；結(jié)合已有文獻報道，牛尾蒿具有多種生物活性，如對煙草甲（Lasioderma serricorne）具趨避活性、抗豬流行性腹瀉病毒等[8–10]；目前牛尾蒿在應用研究上大多為藥用上的研究，有研究指出牛尾蒿提取物對人體致病菌，如白色念珠菌（Candida albicans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和大腸桿菌（Escherichia coli）均有不同程度的抑制活性[11]。

本研究以5 種蒿屬植物的乙醇提取物為供試材料，對2 株馬鈴薯晚疫病菌進行菌絲生長抑制活性測定并進行活性成分篩選，為深入研究其抑菌活性成分、防治馬鈴薯晚疫病提供了新思路，也為植物源新農(nóng)藥的先導化合物開發(fā)提供科學依據(jù)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

植物材料于2018 年5—8 月份采自云南昆明（102°10′～103°40′E，24°23′～26°22′N）、遼寧喀左（119°24′～120°23′E，40°47′～41°33′N）（表1），由西南林業(yè)大學胡世俊副教授鑒定，植物樣品保存于云南省森林災害預警與控制重點實驗室。

表1 供試植物名錄Table 1 List of tested plants

1.1.2 供試菌株

馬鈴薯晚疫病菌pn5502 和pn7604 菌株，由云南省農(nóng)科院趙志堅研究員提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

本實驗采用黑麥培養(yǎng)基。按照黑麥60 g、瓊脂18 g、白砂糖15 g、水1000 mL 的比例制作黑麥培養(yǎng)基。

1.2 儀器與試劑

N?1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司，中國）、柱層析硅膠及GF254 薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠，中國）；72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑（上海杜邦農(nóng)化有限公司，中國），試劑甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿及二甲基亞砜（云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司，中國）等試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物提取物及牛尾蒿提取物不同餾分的制備

植物材料風干粉碎，采用乙醇回流提取法[14]，分別提取3 次，每次4 h。合并3 次提取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，得到乙醇提取物備用。牛尾蒿提取物經(jīng)常壓硅膠柱層析，以石油醚、石油醚?丙酮（V石油醚∶V乙酸乙酯=30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1）、氯仿?甲醇（V氯仿∶V甲醇=1∶1）等溶劑系統(tǒng)依次進行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析檢測，合并相同組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收溶劑，得到Fr1～Fr1010 個不同餾分。

1.3.2 抑菌活性測定方法

已純化的馬鈴薯晚疫病菌在無菌環(huán)境下挑取菌絲接到黑麥培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，每4～5 d進行1 次，直至病菌長滿平板，在菌落邊緣打菌餅備用[15]。采用帶毒平板法[16-17]測定5 種蒿屬植物粗提物抑菌活性，將植物提取物用二甲基亞砜（DMSO）配置成100 mg/mL 的母液并采用巴氏消毒法對母液進行滅菌備用，無菌條件下將一定量的母液加入即將冷卻的已滅菌黑麥培養(yǎng)基中并充分混勻，使提取物最終濃度為1 mg/mL，以含等量DMSO 溶劑的黑麥培養(yǎng)基作為空白對照（CK），陽性對照為同濃度的霜脲·錳鋅。待培養(yǎng)基凝固后，每皿中央接入1 個菌餅（Φ=5 mm），每個處理重復3 次；28 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用十字交叉法對菌落進行測量，記錄其平均直徑。按公式（1）～（2）計算抑制率。

1.3.3 抑制中濃度（EC50）測定方法

將牛尾蒿乙醇提取物餾分Fr1制成0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL 5 個濃度的帶毒平板，觀察2 株馬鈴薯晚疫病菌的生長情況，根據(jù)Fr1在不同濃度下對2 株菌的抑制效果，分別針對2 株菌設定濃度梯度進行毒力測定：1）對菌株pn7604 濃度為62.5、31.25、15.625、7.8125、0 μg/mL；2）對菌株pn5502 濃度為1、5、2.5、1.25、0 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析，分別求出各供試組分的毒力回歸方程、EC50值、95%置信區(qū)間和決定系數(shù)（R2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種植物粗提物的抑菌活性

由表2 可知，5 種植物提取物在1 mg/mL 下對2 株供試病原菌有不同程度的抑菌作用，抑菌率為28.08%～89.04%，不同提取物抑菌作用存在極顯著差異（P<0.01），其中牛尾蒿提取物對供試菌株pn5502、pn7604 的抑菌活性最強，抑菌率分別為89.04%和71.38%。

表2 5 種植物粗提物對馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502、pn7604 的抑制率Table 2 Results of the antifungal activities of 5 plant crude extracts against pn5502 and pn7604 strains of P. infestans

2.2 牛尾蒿各餾分對供試菌株的抑菌活性篩選

由表3 可知，餾分Fr1在0.5 mg/mL 下對2 株供試菌有顯著抑菌活性，抑制率均高達100%，此外餾分Fr2、Fr5、Fr6也顯示出較高的抑菌效果，抑菌率均在50%以上。

表3 牛尾蒿的不同餾分對馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502 的抑制率Table 3 Antifungal activity of different fractions of A.dubia against pn5502 of P. infestans

根據(jù)表4 的活性測定結(jié)果，擬合出各提取物的毒力方程見表5；陽性對照對pn5502、pn7604 的EC50分別為273.8000、155.0000 μg/mL；Fr1對pn5502、pn7604 的EC50分別為7.4733、9.4634 μg/mL，明顯高于陽性對照。

表4 牛尾蒿餾分Fr1 濃度梯度活性篩選Table 4 Concentration gradient activity screening of A.dubia Fr1

表5 Fr1、霜脲·錳鋅對pn5502、pn7604 抑制的回歸分析Table 5 The concentration for 50% of maximal effect of Fr1,cymoxanil·mancozeb on pn5502 and pn7604

2.3 牛尾蒿提取物對菌絲形態(tài)的影響

由圖1 可知，牛尾蒿Fr1餾分處理后的2 株馬鈴薯晚疫病菌與CK 有明顯差異。正常生長的pn5502、pn7604 菌絲體粗細均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布，受抑制的菌絲均產(chǎn)生明顯的畸變，F(xiàn)r1（31.25 μg/mL）處理的pn5502、pn7604 菌絲變得粗大分枝較多，且分枝間距密集，菌絲體內(nèi)含物聚集，細胞壁不光滑，出現(xiàn)明顯畸形。霜脲·錳鋅（250 μg/mL）處理的pn7604 菌絲形態(tài)與Fr1（31.25 μg/mL）處理相似，表明餾分Fr1對pn5502、pn7604 菌絲生長有明顯的抑制效果，且活性明顯高于陽性對照。

圖1 pn5502、pn7604 菌絲生長情況顯微圖Fig.1 Micrograph of mycelium growth of pn5502 and pn7604

3 結(jié)論與討論

目前防治馬鈴薯晚疫病主要依靠培育抗病品種和施用化學藥劑，由于致病疫霉遺傳變異迅速，已出現(xiàn)能克服現(xiàn)有全部抗病基因的菌株，且致病疫霉屬于卵菌，無細胞甲殼素和麥角固醇，單獨使用殺菌劑防治效果差，難以完全有效地控制該病，且單純依靠傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治具有局限性[18-20]，因此尋找新的安全的防治方法勢在必行。近年來，生物防治已成為研究熱點，利用植物源提取物和微生物農(nóng)藥防治馬鈴薯晚疫病受到了越來越多研究者的關注。已有研究表明知母水提取物、九里香乙醇粗提物對致病疫霉的生長和游動孢子釋放有顯著的抑制作用，且提取物的抑制作用與濃度呈正相關，EC50值分別為1.91 mg/mL和6.51 mg/mL，地果甲醇提取物濃度為1 mg/mL時抑菌率達90%[21-24]。本研究篩選了5 種蒿屬植物提取物對2 株馬鈴薯晚疫病菌的抑制活性，結(jié)果表明5 種提取物在濃度為1 mg/mL 的濃度下均對供試菌株具有一定的抑菌活性，其中牛尾蒿提取物對馬鈴薯晚疫病病菌pn5502 和pn7604 的抑菌活性均為最高，青蒿提取物次之；進一步對牛尾蒿提取物的抑菌活性成分進行了追蹤，發(fā)現(xiàn)餾分Fr1具有顯著抑菌活性，在濃度為0.5 mg/mL對2 株供試菌株的抑菌率均高達100%，并且呈顯著的劑量效應，經(jīng)不同濃度梯度測定餾分Fr1對pn5502、pn7604 的EC50值分別為7.4733 μg/mL、9.4634 μg/mL 顯著高于陽性對照藥劑霜脲·錳鋅，其對2 株菌的EC50分別為273.8 μg/mL 和169 μg/mL，顯微觀察發(fā)現(xiàn)被餾分Fr1處理后的菌絲會出現(xiàn)明顯的畸形，因此有必要進一步闡明其抑菌活性成分，及其作用機制。楊立賓等[25]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉發(fā)酵液乙酸乙酯提取物降低了致病疫霉菌體可溶性蛋白含量，降低菌體保護酶活性，使菌體丙二醛含量升高，提高菌體電導率，降低菌體呼吸速率，致病疫霉系統(tǒng)清除自由基出現(xiàn)障礙、細胞膜被破壞、電解質(zhì)外露，對致病疫霉有直接抑制作用。林敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)亞磷酸鹽作為新型植物誘抗劑，除直接作用于致病疫霉菌絲的生長和游動孢子的釋放外，還可以通過刺激植物體內(nèi)抗病物質(zhì)的產(chǎn)生和積累等起到間接防病作用。本研究發(fā)現(xiàn)正常生長的致病疫霉菌絲體粗細均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布，而牛尾蒿餾分Fr1處理后病原菌菌絲體出現(xiàn)分枝增多、表面粗糙、內(nèi)含物聚集等現(xiàn)象，與陽性對照藥劑霜脲·錳鋅處理的癥狀類似，表明致病疫霉處于明顯的脅迫條件。上述異常癥狀的出現(xiàn)可能與牛尾蒿餾分Fr1中存在的活性成分破化了菌體的正常代謝，使得菌體細胞內(nèi)毒性物質(zhì)大量積累，嚴重破壞了細胞膜的完整性，導致菌絲出現(xiàn)畸形。牛尾蒿是我國傳統(tǒng)的藏藥，具有很高的藥用價值[27]。牛尾蒿農(nóng)用研究多為飼喂牲畜、精油化學成分研究、生物多樣性研究、土壤重金屬修復；目前對牛尾蒿生物活性的篩選和評價大多停留在其精油的殺蟲活性[28-31]，而對其化學成分在殺蟲、抑菌等生物農(nóng)藥活性方面報道相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)了牛尾蒿提取物在離體條件下對馬鈴薯晚疫病菌良好的抑菌活性，豐富了牛尾蒿生物活性的范疇，后續(xù)我們可以進一步進行活體實驗，評價其在田間防治馬鈴薯晚疫病的實際防效，闡明具體的活性成分及其作用機制，為進一步開發(fā)綠色無公害、環(huán)境友好型植物源農(nóng)藥[32]提供理論基礎和科學依據(jù)。