程豫然,肖 艷,吳興華,李 哲

(1：中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院, 中國科學(xué)院水庫水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400714)(2：中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)(3：中國長江三峽集團(tuán)有限公司, 北京 100038)

淡水水體富營養(yǎng)化最典型的表征之一是藍(lán)藻水華的形成.近年來，藍(lán)藻水華分布擴(kuò)張范圍大，直接或間接地影響到區(qū)域人類健康，是湖泊、河流和一些河口生態(tài)系統(tǒng)最明顯的威脅之一[1].十多年來，國內(nèi)外已有大量關(guān)于藍(lán)藻水華的研究報(bào)道.探討淡水藍(lán)藻水華暴發(fā)及其優(yōu)勢維持機(jī)制是十多年來學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn).通常認(rèn)為，藍(lán)藻在長期的進(jìn)化過程中發(fā)展了一套獨(dú)特的形態(tài)和生理生化特征，由此產(chǎn)生的高效適應(yīng)性策略為其在種群競爭中提供了非同尋常的優(yōu)勢，是形成水華的前提[2].值得關(guān)注的是，發(fā)生藍(lán)藻水華的典型藻種(如微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabaena)、束絲藻(Aphanizomenon)等)在野外自然條件下主要以群體/聚集體(colony/aggregation)形式出現(xiàn)，而在長期實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)過程中卻常常以單細(xì)胞(unicellular)或單鏈(filament)的形態(tài)存在[3]，即使在室內(nèi)通過控制條件使其達(dá)到高生物量，也難以觀察到藻類細(xì)胞形成野外常見的群體/聚集體進(jìn)而形成水華的現(xiàn)象.盡管普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，藍(lán)藻的形態(tài)可塑性(morphological plasticity)是幫助其在各種不同生境包括極端惡劣的環(huán)境中繁衍的重要策略[4]，但目前有關(guān)藍(lán)藻形態(tài)的研究主要集中在藍(lán)藻群體/聚集體形成的內(nèi)在機(jī)制以及外在影響因子等問題[5]，而對藍(lán)藻形態(tài)可塑性的關(guān)鍵，即包裹于藍(lán)藻細(xì)胞外的功能性結(jié)構(gòu)層——膠被，其如何支撐藍(lán)藻適應(yīng)變化環(huán)境，仍有待深入探索.

近些年，隨著技術(shù)進(jìn)步和成果的積累，研究者加深了膠被在藍(lán)藻形態(tài)響應(yīng)、聚集和水華形成中作用的了解[6].但大量的研究僅僅是將膠被視為一種細(xì)胞分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)，在物質(zhì)層面上對其進(jìn)行表觀分析[7]，并沒有意識到藍(lán)藻膠被的自然生理功能.盡管近些年已經(jīng)有多篇關(guān)于藍(lán)藻EPS的綜述論文[8-9]，但是直到目前還沒有藍(lán)藻膠被生物學(xué)功能及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制研究的總結(jié)報(bào)道.本文嘗試以淡水藍(lán)藻膠被為對象，首先分析文獻(xiàn)來源及回顧已有研究成果，進(jìn)而介紹膠被的特點(diǎn)、產(chǎn)生機(jī)理，并著力于闡述膠被生物學(xué)功能及其分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展，最后評述該研究領(lǐng)域未來的發(fā)展趨勢，期待本文為更深入開展淡水藍(lán)藻水華暴發(fā)和優(yōu)勢維持機(jī)理研究提供參考.

1 文獻(xiàn)來源及分析方法

本綜述檢索的英文論文來源于Web of ScienceTM核心合集Science Citation Index Expand(SCI-Expand)，主題檢索式“TS=(‘cyanobacteria’)AND(‘EPS’ OR ‘extracellular polymeric substances’ OR ‘exopolysaccharides’ OR ‘surface coat’ OR ‘gelatinous’ OR ‘mucilaginous’ OR ‘mucilage’ OR ‘sheath’ OR ‘capsule’ OR ‘slime’)”，檢索年份為所有年份(1900-2020年)；檢索中文論文來源于中國學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)總庫(中國知網(wǎng)，CNKI)，主題檢索式為“SU =‘藍(lán)藻’+ SU =(‘膠被’+‘胞外聚合物’+‘胞外多糖’+‘鞘’+‘莢膜’+‘粘液’)，檢索范圍限制為核心期刊.根據(jù)上述檢索方法共檢索到英文論文1041篇和中文論文41篇，其中英文論文包含69篇綜述(review)和964篇研究型文章(article).對檢索到的中文論文繼續(xù)添加‘功能’或‘合成’作為主題關(guān)鍵詞，分別僅搜索到1篇及3篇論文，故本文對中文文獻(xiàn)不再進(jìn)行詳細(xì)分析，僅作為補(bǔ)充參考.

對檢索到的英文論文關(guān)鍵詞信息進(jìn)行分析，除了“EPS”、“cyanobacteria”、“microalgae”、“biofilm”等基本關(guān)鍵詞，出現(xiàn)頻次較多的關(guān)鍵詞為“Microcystisaeruginosa”、“Synechocystis”、“Nostoc”、“growth”、“photosynthesis”、“nitrogen-fixation”、“diversity”、“biosynthesis”和“scytonemin”，說明主要受到關(guān)注的藍(lán)藻為銅綠微囊藻、集胞藻和念珠藻；主要的研究方向包括膠被對藍(lán)藻生長、固氮和光合作用的影響以及膠被的生物合成和種類等.進(jìn)一步通過引用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域內(nèi)最關(guān)鍵的兩篇論文為De Philippis和Vincenzini[10]，以及Pereira等[8]分別于1998年和2009年發(fā)表的綜述，論文初步歸納出膠被的主要生理功能包括抗逆性(干旱、輻射、氧化、生物礦化、捕食等)及參與藍(lán)藻滑動(dòng).繼續(xù)添加“function”作為關(guān)鍵詞并排除“‘terrestrial’ OR ‘soil’ OR ‘desert’ OR ‘marine’”等主題檢索詞后，檢索到英文論文55篇，包含3篇綜述和51篇研究型文章，分析關(guān)鍵詞發(fā)現(xiàn)膠被功能的研究還涉及到生物吸附、生物修復(fù)及群體形成.

另一方面，在原檢索式中添加“biosynthesis”作為關(guān)鍵詞并排除“‘terrestrial’ OR ‘soil’ OR ‘desert’ OR ‘marine’”等主題檢索詞后，共檢索到英文論文47篇，包含5篇綜述及42篇研究型文章.引用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析顯示關(guān)鍵文章為Pereira團(tuán)隊(duì)分別于2009[8]、2013[11]及2015年[12]發(fā)表的3篇論文，論文中引用了細(xì)菌EPS的合成途徑包括Wzy途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑以及合成酶途徑，提出藍(lán)藻膠被合成可能含有類似的通路.進(jìn)一步添加“‘molecular regulation’ OR ‘molecular mechanism’”作為關(guān)鍵詞后，檢索到英文論文13篇，包含3篇綜述及10篇研究型文章.對膠被合成及調(diào)控相關(guān)論文的分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻膠被合成還未有確定通路，且對于其調(diào)控的研究多集中于膠被EPS產(chǎn)量變化，微觀分子的調(diào)控機(jī)制還有待探索.

綜上，對篩選出的淡水藍(lán)藻膠被各項(xiàng)功能及合成途徑關(guān)鍵詞分別進(jìn)行了梳理，論文匯總情況見圖1，結(jié)果顯示對藍(lán)藻膠被的研究多集中于膠被對外界環(huán)境因子(如pH、溫度和金屬離子等)的響應(yīng)，且部分關(guān)于某些環(huán)境脅迫的論文僅有實(shí)驗(yàn)觀察到促進(jìn)或抑制膠被分泌，而對于膠被的具體功能未有詳細(xì)闡釋.另外，關(guān)于藍(lán)藻膠被的合成通路及分子調(diào)控機(jī)制的論文寥寥可數(shù)，仍需進(jìn)一步探索.據(jù)此，本綜述以當(dāng)前淡水藍(lán)藻膠被一般性認(rèn)識為切入點(diǎn)逐層次展開.

圖1 關(guān)于淡水藍(lán)藻膠被生物學(xué)功能及合成途徑的SCI論文數(shù)量

2 膠被的來源、結(jié)構(gòu)組分和一般特性

膠被是一種廣泛存在于微生物以及一些植物和動(dòng)物細(xì)胞周圍的功能性結(jié)構(gòu).藍(lán)藻的膠被包裹于細(xì)胞或藻絲或群體外，并伴隨著藍(lán)藻細(xì)胞的生長繁殖不斷形成、分泌或部分釋放于周圍水體中.其主要來源于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的致密顆粒逐漸分泌到細(xì)胞外，均勻分布于整個(gè)細(xì)胞表面，或從細(xì)胞的某一端點(diǎn)擠出以進(jìn)行定向運(yùn)動(dòng)[13].

目前普遍認(rèn)為，藍(lán)藻膠被根據(jù)形態(tài)可分為鞘(sheath)、莢膜(capsule)以及粘液(slime)[10]，淡水水體中常見具有膠被的藍(lán)藻及其膠被類型歸納見表1.鞘層薄而均勻，在光學(xué)顯微鏡下直接觀察可見；莢膜通常是一層厚而粘稠的結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞表面緊密相連，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)上下連貫，不含顆粒，用印度墨水染色后光學(xué)顯微鏡下觀察可見；粘液是最外一層，分散在細(xì)胞周圍，不能反映細(xì)胞的形狀(圖2).亦有學(xué)者根據(jù)藍(lán)藻EPS與細(xì)胞結(jié)合的緊密程度，將其分為緊密結(jié)合型(tightly bound extracellular polymers，TB-EPS)、松散結(jié)合型(loosely bound extracellular polymers，LB-EPS)和溶解型(soluble extracellular polymers，S-EPS)[14].

表1 淡水水體中部分常見具有膠被的藍(lán)藻及其膠被類型

圖2 藍(lán)藻的不同膠被形態(tài)：(a)FACHB-599念珠藻；(b)FACHB-82魚腥藻；(c)FACHB-2427微囊藻(a：未染色，鞘：黑箭頭；b，c：印度墨水染色，莢膜：白箭頭，粘液：紅箭頭)

藍(lán)藻膠被的主要成分為多糖和蛋白質(zhì)，及少量核酸、脂類、腐殖酸等，并富含羧基、氨基、脂基等有機(jī)官能團(tuán)[27].各組分具有不同的空間分布特征，如緊密結(jié)合型膠被中多糖含量較高，松散結(jié)合型則蛋白質(zhì)和腐殖酸含量較高，溶解型主要是親水性有機(jī)物，含有大量的羧基、羥基、氨基等官能團(tuán)[28].膠被的組分對其物化特性也有一定的影響.如野外自然環(huán)境和室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻其表面電荷均帶負(fù)電，這是由于官能團(tuán)(如羧基)的解離，使膠被在接近中性pH時(shí)帶負(fù)電[29].而膠被中存在的乙?；㈦幕腿パ趸?例如海藻糖和鼠李糖)，使得膠被具有疏水性[30].此外，大量酸性多糖使得膠被具有很強(qiáng)的粘附性，促進(jìn)藻細(xì)胞的聚集和群體形成[31].

3 淡水藍(lán)藻膠被的生物學(xué)功能

膠被的形成和保留毫無疑問可為生物體帶來一定的益處，這也在文獻(xiàn)中得到證實(shí)[32].目前，對淡水藍(lán)藻膠被生物學(xué)功能的認(rèn)識主要包括以下4個(gè)方面：(1)膠被作為保護(hù)屏障抵御外界脅迫；(2)膠被參與藍(lán)藻營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞、吸收和儲存；(3)膠被參與藍(lán)藻運(yùn)動(dòng)遷移過程；(4)膠被對藍(lán)藻聚集和水華形成起到一定作用.現(xiàn)分別歸納分析如下：

3.1 膠被作為保護(hù)屏障抵御外界脅迫

已有的研究表明，膠被對紫外線輻射、氧化、有毒化合物和原生動(dòng)物的捕食等不利環(huán)境因素具有防御作用[8].許多生活在高太陽輻射環(huán)境中的藍(lán)藻已被證實(shí)其鞘中含有偽枝藻素(scytonemin)、霉菌素樣氨基酸(mycosporine-like amino acids，MAAs)等吸收紫外線的色素[33]；近年對于淡水中極端嗜熱藍(lán)藻的研究還發(fā)現(xiàn)其胞外膠被中存在另一種屏蔽紫外線的色素——膠球藻素(gloeocapsin)[34]；Ehling-Schulz等[35]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外線可誘導(dǎo)念珠藻膠被多糖的分泌增加，以及這些色素在膠被中的累積，使得膠被成為阻止有害紫外線輻射穿透的屏障.早期的研究發(fā)現(xiàn)，膠被為藍(lán)藻細(xì)胞提供了低氧化還原的微環(huán)境，這種微環(huán)境可以使藍(lán)藻避免環(huán)境中氧氣的危害[10]，后有實(shí)驗(yàn)證明缺乏膠被的集胞藻對氧化應(yīng)激高度敏感，推測膠被可通過吸收或散射太陽輻射、清除周圍環(huán)境中的活性氧以及改變微生物群落結(jié)構(gòu)的完整性或表面電荷來減少氧化應(yīng)激[36].由于膠被中含有多種帶負(fù)電荷的官能團(tuán)，其對環(huán)境中的金屬陽離子被證實(shí)存在兩方面的作用：一是可螯合富集在環(huán)境中濃度較低但對藍(lán)藻生長有重要作用的金屬離子[37]，例如銅綠微囊藻膠被表面更多的負(fù)電荷增加了其在諸如鐵離子等微量元素富集中的競爭力，能一定程度上解釋它能長時(shí)間、大規(guī)模在湖泊水體中占據(jù)優(yōu)勢的原因[6]；二是膠被作為一種保護(hù)結(jié)構(gòu)防止細(xì)胞直接與環(huán)境中的有毒重金屬接觸[38]，重金屬納米顆粒會誘導(dǎo)膠被分泌增加用于保護(hù)細(xì)胞維持完整結(jié)構(gòu)[39].而當(dāng)藍(lán)藻處于浮游動(dòng)物的攝食壓力下時(shí)，一方面形成大的群體細(xì)胞可抵御捕食者，減少死亡率；另一方面藍(lán)藻群體凝膠狀粘液膠被的存在，可機(jī)械地干擾浮游動(dòng)物的攝食作用，這種黏稠的多糖影響了浮游動(dòng)物攝食和消化藍(lán)藻的能力，在膠被的保護(hù)下藻類在通過浮游動(dòng)物的腸道后仍能保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致浮游動(dòng)物對其同化效率很低[40].此外，對極端野外環(huán)境(如極地冰川、酸性河流等)的樣品調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件強(qiáng)烈影響藻類膠被的組成，例如膠被中半乳糖的含量與溫度呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，而極酸性條件會使得膠被分泌增多且其中甲基葡萄糖占比升高，證明藻類會通過調(diào)節(jié)膠被特性來適應(yīng)不同的環(huán)境壓力[41].因此，膠被作為藍(lán)藻細(xì)胞感應(yīng)外界環(huán)境的最外層，是對外界環(huán)境響應(yīng)、調(diào)節(jié)自身生存策略的主要結(jié)果體現(xiàn).

3.2 膠被參與藍(lán)藻營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞、吸收和儲存

早期的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在相同的無機(jī)養(yǎng)分濃度下，藍(lán)藻在天然水體中的生長比在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)生長的好；添加微量的無機(jī)營養(yǎng)鹽可能會對天然水體中的藍(lán)藻生長產(chǎn)生顯著影響，而對在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中的藍(lán)藻則沒有影響[42].基于此，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的藍(lán)藻由于形態(tài)上的變化(如從群體變?yōu)閱渭?xì)胞、從聚集體變?yōu)閱捂?而被視為衰弱和半生病的細(xì)胞.因此，Lange[43]提出膠被除了在藻細(xì)胞與周圍外界環(huán)境之間提供物理屏障外，同時(shí)也為細(xì)胞提供了必要營養(yǎng)元素和微量元素的微環(huán)境.Fang等[44]對太湖藍(lán)藻的研究也發(fā)現(xiàn)群體和分散的單細(xì)胞之間的生理微環(huán)境有很大差異，解釋了富含膠被的藍(lán)藻在營養(yǎng)鹽吸收和儲存能力上的優(yōu)勢.有學(xué)者認(rèn)為，由于膠被中保留了部分胞外酶，因此形成了一種外部消化系統(tǒng)，可將水體中溶解的或顆粒狀的營養(yǎng)物質(zhì)分離富集出來作為營養(yǎng)源和能源[45].Zhou等[46]在對集胞藻生長過程中磷的分布及轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，膠被是無機(jī)磷的重要儲存庫，且當(dāng)外界無機(jī)磷耗盡時(shí)，膠被中無機(jī)磷的解吸成為胞內(nèi)磷的主要來源.在C/N營養(yǎng)不平衡時(shí)，念珠藻的膠被會充當(dāng)固定的過量碳的匯[47]，且同位素示蹤實(shí)驗(yàn)亦表明藍(lán)藻會重新利用其儲存在膠被中的有機(jī)碳[48].

研究還發(fā)現(xiàn)，氮或磷營養(yǎng)元素饑餓的條件，反而促進(jìn)了藻類膠被的合成[49-50]，也可從側(cè)面反映了在缺乏營養(yǎng)的條件下膠被對保證藻類生存起到一定作用.Yao等[51]提出在藻類吸附無機(jī)磷的過程中，膠被對磷的吸收是一個(gè)獨(dú)立于胞內(nèi)吸附的不同過程.在不同藻類中，膠被對磷的吸收可占總細(xì)胞的60%～90%[52].而藍(lán)藻細(xì)胞的磷庫和營養(yǎng)儲藏轉(zhuǎn)化-奢侈消費(fèi)機(jī)制，使其對較低濃度的磷親和力更高，原因可能是因?yàn)槟z被粘液的特殊功能，在其營養(yǎng)的吸收和利用方面起重要作用[53-54].

3.3 膠被參與藍(lán)藻運(yùn)動(dòng)遷移過程

運(yùn)動(dòng)性是藍(lán)藻在自然水體中存活的一項(xiàng)重要能力.對于無鞭毛的絲狀藍(lán)藻來說，有科學(xué)家猜測粘液物質(zhì)有可能在其運(yùn)動(dòng)上具有一定的功能.直到1995年，Hoiczyk研究小組基于對巨顫藻(Oscillatoriaprinceps)、鉤狀席藻(Phormidiumuncinatum)和銅綠鞘絲藻(Lyngbyaaeruginosa)包膜的觀察，最早提出了藍(lán)藻滑動(dòng)所需的動(dòng)力由包膜上特殊排列的原纖維間的剪切力以及分泌到胞外的粘液的持續(xù)流動(dòng)提供[22].進(jìn)一步對絲狀藍(lán)藻的滑動(dòng)模式進(jìn)行更具體的表征時(shí)，發(fā)現(xiàn)了分泌粘液的原核“細(xì)胞器”孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞通過“連接孔”分泌粘液推動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[58].該研究直接證明了藍(lán)藻細(xì)胞分泌粘液的生物學(xué)功能.Dhahri等[59]對念珠藻活細(xì)胞滑動(dòng)進(jìn)行原子力顯微成像(atomic force microscopy，AFM)，研究了膠被粘液流變特性對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)膠被粘液厚度隨運(yùn)動(dòng)速度的增加而增加.

除了參與藍(lán)藻細(xì)胞的滑行運(yùn)動(dòng)，膠被的存在還會影響藍(lán)藻在水體中的遷移.Brookes和Ganf[60]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻群體的膠被可在細(xì)胞間形成空隙，與偽空泡共同提供浮力，利于藍(lán)藻群體的垂直遷移.同時(shí)，Reynolds[32]認(rèn)為，在含有相同細(xì)胞數(shù)的藍(lán)藻群體之間，有膠被的群體密度比無膠被的群體密度更低，更有利于群體的上浮.而Dervaux等[61]提出了一種與細(xì)胞內(nèi)偽空胞無關(guān)的藍(lán)藻上浮機(jī)制——適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和光照帶來的高光合作用導(dǎo)致溶解氧過飽和并成為核氣泡，這些氣泡困在膠被中直至其浮力足以拉動(dòng)群體上浮至水體表層，這種說法有待進(jìn)一步研究.

3.4 膠被對藍(lán)藻聚集和水華形成起到一定作用

4 膠被合成的分子機(jī)制的研究現(xiàn)狀

4.1 膠被生物合成通路

目前關(guān)于藍(lán)藻膠被多糖合成的分子機(jī)制主要是基于細(xì)菌EPS合成通路——Wzy途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑、合成酶途徑(圖3～5)進(jìn)行的研究，每種途徑中的關(guān)鍵蛋白及其功能見表2.

表2 膠被多糖合成3種途徑中的關(guān)鍵蛋白及其作用[8,67-68]

圖3 Wzy依賴途徑[8]：以在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜的界面處寡糖脂質(zhì)連接的重復(fù)單元的組裝開始，隨后重復(fù)單元被整合蛋白Wzx轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的周質(zhì)側(cè)，并被Wzy聚合，聚合反應(yīng)受多糖共聚酶蛋白Wzc的活性影響，而其活性受磷酸酶Wzb控制，且行使功能時(shí)消耗ATP，該蛋白與多糖輸出蛋白Wza形成復(fù)合物，從而允許聚合物的輸出(實(shí)線表示直接轉(zhuǎn)化過程，虛線表示間接參與過程)

2009年，Pereira等研究小組提出了基于細(xì)菌Wzy途徑的藍(lán)藻膠被多糖合成模型，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單糖在糖活化和修飾酶的作用下形成糖核苷酸；在質(zhì)膜上，通過糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases，GTs)將糖核苷酸依次添加到脂質(zhì)載體上來組裝重復(fù)單元；寡糖脂連重復(fù)單元經(jīng)Wzx蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜的周質(zhì)側(cè)，并經(jīng)Wzy蛋白聚合.隨后，聚合物分別由多糖共聚酶和外膜多糖輸出蛋白家族成員Wzc和Wza形成的復(fù)合物通過外膜輸出，其中Wzc磷酸化狀態(tài)由磷酸酶Wzb控制，可通過其狀態(tài)控制聚合物鏈長，并且與Wza相互作用潛在地調(diào)節(jié)復(fù)合物構(gòu)象以打開或關(guān)閉通道[8].

在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑中，多糖在質(zhì)膜內(nèi)小葉處完全聚合，后經(jīng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(KpsM和KpsT)轉(zhuǎn)運(yùn)，在還原末端通過聚-2-酮-3-脫氧辛二酸(Kdo)連接到終端脂質(zhì)，其中KpsC、KpsS、KpsF和KpsU蛋白被認(rèn)為參與了Kdo連接劑或其活性供體的合成，這是與Wzy途徑的主要區(qū)別，最后在多糖共聚酶蛋白以及多糖輸出蛋白的作用下輸出胞外[67].

合成酶途徑一般來說可分為2種，一種是合成藻酸鹽，一種是合成纖維素.首先通過合成酶Alg8或BcsA(分別存在于藻酸鹽或纖維素產(chǎn)生中)，多糖同時(shí)聚合和輸出到質(zhì)膜上，AlgI、AlgF、AlgG在質(zhì)內(nèi)參與聚合物修飾，AlgL降解積累的褐藻酸鹽，BcsZ可能具有類似水解作用，BcsQ為極性定位提供條件.含有四肽重復(fù)(tetratricopeptide repeat，TPR)的外膜脂蛋白AlgK可以將成熟聚合物導(dǎo)向完整的外膜蛋白AlgE，從而促進(jìn)藻酸鹽跨外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，對于纖維素其輸出則是由BcsC蛋白完成[68].

基于以上在細(xì)菌中確立的胞外多糖合成通路，研究者在藍(lán)藻中進(jìn)行了探索.Pereira等[11]對已經(jīng)完成測序的24種屬于不同亞科、具有不同形態(tài)和生態(tài)位的藍(lán)藻進(jìn)行了分析，檢測其是否具有Wzy及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑所需蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Wz-或Kps-同源序列，結(jié)果顯示藍(lán)藻中Wz-同源序列豐度較高，表明其膠被合成可能主要依賴Wzy途徑，但同時(shí)部分藻株中未發(fā)現(xiàn)Wzx同源序列，推測藍(lán)藻膠被合成可能不完全符合現(xiàn)有模型.Chrismas等[69]對北極藍(lán)藻Phormidesmispriestleyi基因組研究發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)基因簇包含Wzy途徑中wza、wzc、wzx和wzy保守序列，且含有生物合成(WcaA結(jié)構(gòu)域)和組裝(糖基轉(zhuǎn)移酶，RfaB結(jié)構(gòu)域)的結(jié)構(gòu)域的基因；同時(shí)，另在2個(gè)基因簇發(fā)現(xiàn)有基因含有ABC途徑中KpsD、KpsE、KpsM、KpsT的結(jié)構(gòu)域.該研究直接證明了藍(lán)藻膠被胞外多糖的合成存在有多種途徑共存的情況.然而，在藍(lán)藻基因組中暫未發(fā)現(xiàn)有完整的合成酶通路(合成藻酸鹽或合成纖維素)，但有研究表明在褐藻的胞外基質(zhì)中存在藻酸鹽成分，且部分合成步驟中的蛋白都可找到同源序列[70].Pereira等[12]對124株藍(lán)藻進(jìn)行了全基因組分析，結(jié)果表明大多數(shù)藻株攜帶的基因編碼的蛋白質(zhì)與上述3種主要途徑相關(guān)，但通常不是定義一條途徑的完整序列，進(jìn)一步說明了藍(lán)藻膠被多糖的合成可能不嚴(yán)格遵循先前表征的途徑之一.

圖4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴途徑[67]：在由包含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(KpsM)和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KpsT)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通過質(zhì)膜之前，多糖在質(zhì)膜表面完全聚合，聚合物通過周質(zhì)和外膜的輸出是由多糖共聚酶蛋白KpsE和多糖輸出蛋白KpsD進(jìn)行(實(shí)線表示直接轉(zhuǎn)化過程，虛線表示該蛋白具體參與形式未知)

圖5 合成酶依賴途徑[68]：多糖被內(nèi)膜合成酶蛋白聚合并通過內(nèi)膜輸出，在一些情況下，多糖合成酶的活性由內(nèi)膜c-di-GMP受體翻譯后調(diào)節(jié)，然后多糖通過含TPR的周質(zhì)蛋白和完整的外膜β桶狀蛋白穿過外膜輸出(縮寫釋義：c-di-GMP，雙(3′-5′)-環(huán)二聚鳥苷單磷酸；GDP-ManUA，鳥苷二磷酸-甘露糖醛酸；UDP-Glc，尿苷二磷酸葡萄糖.實(shí)線表示直接轉(zhuǎn)化過程，虛線表示該蛋白具體參與形式未知)

除多糖外，膠被中的另一重要成分蛋白質(zhì)，按照其結(jié)構(gòu)功能可分為結(jié)構(gòu)性蛋白和非結(jié)構(gòu)性蛋白.結(jié)構(gòu)蛋白在藍(lán)藻聚集體形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起到重要作用.已有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻胞外蛋白凝集素(microvirin，MVN)能與脂多糖結(jié)合并參與群體的形成中[71]；胞外糖蛋白MrpC參與了微囊藻細(xì)胞間的相互作用[72].而非結(jié)構(gòu)蛋白胞外酶等，在降解聚合物為藍(lán)藻提供可利用的小分子物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用[45].關(guān)于胞外蛋白合成通路，在革蘭氏陰性菌中已發(fā),6種途徑，其中最簡單的為Ⅰ型途徑(T1SS)，在此途徑中外膜蛋白TolC與跨質(zhì)膜的α螺旋桶蛋白以及被膜包裹的β桶蛋白形成通道，而TolC蛋白能與不同的內(nèi)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用從而分泌特異性蛋白[73].然而，目前關(guān)于藍(lán)藻胞外蛋白合成通路研究較少.有研究在部分藍(lán)藻中鑒定出了Ⅰ型分泌途徑的底物[74]；Moslavac等[75]發(fā)現(xiàn)魚腥藻具有TolC蛋白的同系物HgdD，且后續(xù)研究證明此同系物直接參與了胞外蛋白分泌，并對部分蛋白存在質(zhì)量控制機(jī)制[76]；另有研究發(fā)現(xiàn)集胞藻體內(nèi)的另一同系物Slr1270也具有相似功能[77].因此，藍(lán)藻膠被蛋白的合成機(jī)制仍需進(jìn)一步探索研究.

4.2 膠被合成及其響應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制

許多研究表明, 藍(lán)藻膠被的合成及其生物化學(xué)特性主要受鹽度、pH、光照、溫度和營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子的調(diào)節(jié)[8].目前關(guān)于藍(lán)藻在變化環(huán)境下調(diào)控膠被的分子機(jī)制的研究并不多.Fisher等[78]發(fā)現(xiàn)可通過改變ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和(或)糖基轉(zhuǎn)移酶的不同組合來改變膠被EPS的組分，進(jìn)而改變集胞藻的表面特性.近期有研究發(fā)現(xiàn)，多糖共聚酶蛋白Wzc表現(xiàn)出自磷酸化活性，且可作為Wzb蛋白的底物受其去磷酸化作用，這一過程可調(diào)控膠被的合成[79].此外，在藍(lán)藻膠被響應(yīng)外界環(huán)境因子的分子調(diào)控方面，Chrismas等[69]從基因組層面發(fā)現(xiàn)北極藍(lán)藻P.priestleyie中存在一條幾乎完整的Wsp感應(yīng)通路，通過調(diào)控胞內(nèi)信使雙(3′-5′)-環(huán)二聚鳥苷單磷酸(c-di-GMP)而參與調(diào)節(jié)膠被的生物合成，并證明了P.priestleyie主要通過利用糖類產(chǎn)生一種特殊的保護(hù)粘層使其細(xì)胞免受凍害，從而在北極的冬季環(huán)境中生存.Zhang等[80]對微重力條件下的集胞藻基因表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明參與糖原降解的基因glgP在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中其表達(dá)量都增加，為膠被多糖合成提供了前體物質(zhì)，且在微重力不同階段參與EPS合成(epsD)及輸出(epsB)的基因的不同變化趨勢，表明其增加的來源分別是胞外轉(zhuǎn)運(yùn)或是膠被的從頭合成，一定程度解釋了藍(lán)藻在太空中的生存適應(yīng)機(jī)制.Han等[81]研究了不同光照對膠被多糖的影響，提出光質(zhì)量通過提高活性氧(ROS)水平以作為信號分子來刺激膠被多糖的合成；紅光、藍(lán)光以及混合光照首先改變碳的分配促進(jìn)了膠被前體糖核苷酸的合成，其次GTs轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)以促進(jìn)寡糖重復(fù)單元的形成，以此增加了膠被多糖的積累.此外，Gan等[82]發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素可通過激活產(chǎn)毒及非產(chǎn)毒微囊藻細(xì)胞中部分與膠被多糖合成相關(guān)基因(capD，csaB，tagH，epsL)的表達(dá)，誘導(dǎo)一系列胞外多糖產(chǎn)物的釋放，進(jìn)而促進(jìn)微囊藻群體的聚集.同時(shí)，有研究亦表明產(chǎn)毒銅綠微囊藻中微囊藻毒素會影響凝集素MVN的表達(dá)，在微囊藻毒素基因(mcyB或mcyH)缺失的菌株中MVN只能形成寡聚體而無法形成多聚體，從而影響微囊藻細(xì)胞間的相互作用[71].

膠被在藍(lán)藻適應(yīng)性策略中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能.目前傾向于認(rèn)為，膠被的產(chǎn)生起源于調(diào)節(jié)細(xì)胞中積累且不會釋放到溶液中的光合產(chǎn)物[82]，而藻細(xì)胞穿上這層“外衣”可通過減緩擴(kuò)散使得不必要的代謝活動(dòng)最小化，但目前已有研究僅揭示了環(huán)境壓力會導(dǎo)致膠被分泌變化，膠被合成和降解通路的研究相對而言較為匱乏，其在變化環(huán)境下的分子調(diào)控機(jī)制仍還有待深入探討.

5 研究展望

在全球氣候變化背景下，藍(lán)藻將會在淡水水體生態(tài)系統(tǒng)中長期占據(jù)優(yōu)勢.藍(lán)藻如何優(yōu)化膠被形成與功能以適應(yīng)環(huán)境脅迫、如何調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，仍是未知問題.在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，針對藍(lán)藻研究仍缺乏有效的遺傳操縱系統(tǒng)，從而使得藍(lán)藻膠被合成及其分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展緩慢.對于大多數(shù)藍(lán)藻而言，可用的選擇標(biāo)記有限導(dǎo)致無法針對藍(lán)藻細(xì)胞中的多個(gè)基因或途徑進(jìn)行全面的代謝調(diào)節(jié)；另外，常規(guī)的藍(lán)藻基因刪除方法可能導(dǎo)致致死表型，進(jìn)而難以闡明特定的基因或代謝途徑[83].因此，未來研究可著力開發(fā)新基因組編輯工具及mRNA增強(qiáng)子等適用于藍(lán)藻的各類遺傳工具，建立基因組尺度的建模分析系統(tǒng)，以促進(jìn)藍(lán)藻膠被生物合成分子機(jī)制等基礎(chǔ)研究.

此外，在有限的資源條件下，藍(lán)藻對膠被的高效“投資”策略很可能與其他生存策略的表達(dá)產(chǎn)生“代謝競爭”，藍(lán)藻如何權(quán)衡(trade-off)并選擇最優(yōu)策略，其科學(xué)的認(rèn)識仍顯不足，尚需深入探索.未來，可考慮依靠基因組學(xué)與代謝組學(xué)方法，解析膠被對環(huán)境變化響應(yīng)的機(jī)制，更全面的探究藍(lán)藻膠被合成和分泌過程中具體的響應(yīng)信號體系，解析不同類型蛋白在膠被生成和降解、碳循環(huán)和能量通量中的定量貢獻(xiàn).碳源作為合成膠被的物質(zhì)基礎(chǔ)，在環(huán)境變化時(shí)，如何在各大生理過程之間周轉(zhuǎn)以供應(yīng)需求，也是未來值得關(guān)注的問題.