曹柯萌，賈 夏，，王子威，閆占寬，張寧靜

（1.長安大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室，西安 710054；2.長安大學(xué)土地工程學(xué)院陜西省土地工程重點實驗室，西安 710054；3.江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，江蘇連云港 222000）

酚酸是高等植物中廣泛分布的一類重要次生代謝物，作為信號分子，酚酸在植物與微生物的共生、植物防御及抵抗不良環(huán)境等方面起重要作用［1-2］，可調(diào)節(jié)植物生長，并具有抗氧化、酶抑制及紫外線阻斷作用；同時，作為合成木質(zhì)素的中間體，酚酸類物質(zhì)對于植物結(jié)構(gòu)的形成也具有重要作用；此外，根系酚酸的積累除可能提高根系分泌酚酸的能力外，還有助植物根系抵抗不利環(huán)境.而酚酸的合成易受環(huán)境變化如氣溫、大氣CO2濃度和土壤重金屬污染的影響，因而這些環(huán)境因子的變化會影響根系酚酸的積累.

大氣CO2濃度呈逐年上升趨勢已獲國際社會的廣泛認(rèn)可［3］.研究表明，大氣CO2濃度升高下植物光合產(chǎn)物明顯增加［4-6］，而光合產(chǎn)物的增加可影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成［7-9］，進而影響其根系次生產(chǎn)物的含量.此外，土壤重金屬污染也是目前面臨的一類重要無機污染問題，其中鎘（Cd）是土壤污染主要類型之一［10］.研究表明，Cd會誘導(dǎo)植物酚酸的生物合成及積累［6］，而酚酸的羥基和羧基等具有絡(luò)合重金屬的能力［11-12］，故可降低金屬的自由離子態(tài)濃度，緩減其對植物的生物毒性.在當(dāng)前大氣CO2濃度升高和土壤Cd污染共存情景下，植物酚酸合成可能不同于單一條件［13-14］，而這種差異會影響其根系酚酸的積累特征，進而影響Cd的生物可以利用性，關(guān)系污染土壤的植物修復(fù)效率，然而，目前這方面的研究還甚少見.據(jù)此，本研究以刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）幼苗為例，探究大氣CO2濃度升高和土壤Cd污染耦合對其根系酚酸含量的影響.

刺槐生長速度快、根系發(fā)達(dá)、更新萌芽能力強、幼苗成活率高及耐干旱貧瘠等［15-16］，是我國“三北防護林工程”、農(nóng)田防護林及干旱半干旱地區(qū)水土保持的主要造林樹種之一，在改善區(qū)域生態(tài)環(huán)境和生態(tài)服務(wù)功能等方面具有重要意義［15］.已有研究表明刺槐可合成多種酚酸類化合物如對羥基苯甲酸、沒食子酸、對香豆酸和咖啡酸［17-20］，故本研究主要探討大氣CO2濃度升高和土壤Cd污染耦合對刺槐幼苗根系酚酸類化合物積累的影響特征，其研究結(jié)果對了解全球變化背景下植物對土壤重金屬污染的抗性特征具有重要科學(xué)意義.

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤來源于長安大學(xué)渭水校區(qū)原位試驗場，土壤類型為淋溶土，其基本理化性質(zhì)為pH值7.69，總碳12.51 g·kg-1，總氮1.31 g·kg-1，有效氮11.14 mg·kg-1，速效磷48.66 mg·kg-1，速效鉀151.97 mg·kg-1，陽離子交換量27.99 meq·（100 g）-1，可溶性鹽376.14 mg·kg-1，總Cd 2.88 mg·kg-1.除去雜物后過2 mm篩混勻，向土壤中添加CdSO4·8H2O水溶液后混勻，暗處放置平衡5個月（期間經(jīng)常攪拌以使Cd分布均勻）.依據(jù)國家《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）關(guān)于pH＞7時Cd的農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險篩選值（0.6 mg·kg-1）和風(fēng)險管制值（4.0 mg·kg-1）共設(shè)0、0.45和4.5 mg·kg-1干土3個Cd處理水平，分別記為Cd0、Cd1和Cd10.刺槐種子購置于西北農(nóng)林科技大學(xué)林業(yè)科學(xué)研究院.

1.2 試驗設(shè)計

將平衡好的土壤裝入實驗盆（長30 cm×寬15 cm×高20 cm），每盆裝處理土壤約10 kg，以一定株距和行距種植刺槐種子后將盆栽放入帶有CO2濃度控制系統(tǒng)的植物培養(yǎng)箱（Percival E-36L2，美國）和對照箱進行培養(yǎng).

CO2濃度設(shè)置2個水平：高濃度CO2（750μmol·L-1）和大氣CO2濃度（385μmol·L-1）.耦合處理分為高濃度CO2+Cd（Cd0、Cd1和Cd10）和大氣CO2+Cd（Cd0、Cd1和Cd10）兩大類，具體處理如下.對照：大氣CO2-Cd0；單獨Cd處理：大氣CO2-Cd1和大氣CO2-Cd10；單獨大氣CO2濃度升高：高濃度CO2-Cd0；耦合條件處理：高濃度CO2-Cd1和高濃度CO2-Cd10；每處理重復(fù)3次.

幼苗培養(yǎng)參數(shù)：濕度為65%～69%，平均溫度為25℃，平均光通量550μmol·m-2·s-1，光周期12 h.幼苗生長期間定期用自來水澆灌，保持土壤田間持水量約為62.7%.在實驗過程中及時清理盆中雜草和凋落葉片，并經(jīng)常更換盆栽位置以減少培養(yǎng)箱小氣候的影響.

1.3 樣品采集及所選指標(biāo)分析

1.3.1 根系樣品采集 在幼苗生長45、90和135 d時挖取幼苗根系，經(jīng)自來水沖洗干凈后于95℃烘箱殺青5 min并在65℃下烘干至恒重，干根經(jīng)粉碎后備用.

1.3.2 根系酚酸提取及總酚酸含量的測定 準(zhǔn)確稱取根粉5 g，用25 mL 50%的乙醇混勻后回流提取1 h后過濾，濾液經(jīng)濃縮定容至25 mL后備用.總酚酸含量以咖啡酸為標(biāo)樣，采用普魯士藍(lán)比色法測定［21］.

1.3.3 幾種酚酸單體含量測定 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：配制濃度為2、5、10、20和32μg·mL-1的沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和對香豆素酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后經(jīng)高效液相色譜（日本島津，LC-2030C 3D Plus）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST反相C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相采用pH 2.7的冰乙酸和乙腈進行梯度洗脫，梯度變化見表1；柱溫為30℃，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10μL.檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為285 nm.

樣品溶液制備：濃縮土壤提取溶液近干至浸膏，用色譜甲醇定容至10 mL，過0.22μm濾膜過濾得待測樣液用于高效液相色譜分析酚酸單體含量.

1.3.4 根系Cd含量分析 根系Cd含量數(shù)據(jù)已出版［22］，本文僅引用來分析其對根系酚酸積累的影響.

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedures

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件.采用三因素方差分析法分析CO2、Cd、時間及其交互作用對刺槐根系酚酸積累的影響，影響顯著時采用Duncan（鄧肯新復(fù)極差法，Duncan’s multiple range test）分析不同處理間的差異性；采用皮爾遜相關(guān)分析法分析酚酸積累和根系Cd含量的關(guān)系.繪圖采用利用Sigmaplot14.0軟件進行.

2 結(jié)果與分析

圖1 不同處理下刺槐幼苗根系總酚酸含量Fig.1 The content of total phenolic acids in the roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

2.1 大氣CO2濃度升高和土壤Cd污染耦合對幼苗根系總酚酸積累的影響

由圖1可知，大氣CO2-Cd1和大氣CO2-Cd10處理下幼苗根系總酚酸積累在45 d時較大氣CO2-Cd0下顯著增加（P＜0.05），而90和135 d時較大氣CO2-Cd0下顯著降低（P＜0.05），總體上酚酸積累隨生長時間的延長而增加，且135 d時酚酸含量最高.高濃度CO2-Cd0處理下，總酚酸積累在90 d時較大氣CO2-Cd0下顯著增加（P＜0.05），135 d時較大氣CO2-Cd0下顯著降低（P＜0.05），且隨著生長時間的延長，根系總酚酸積累較45 d時顯著增加（P＜0.05）.耦合處理下，總酚酸積累均較大氣CO2-Cd0降低，但較單一Cd處理下顯著增加（P＜0.05）.總體看，CO2、Cd及生長時間對根系總酚酸積累的單一及交互作用顯著（P＜0.05）（表2）.

表2 刺槐幼苗根系酚酸含量的三因素方差分析結(jié)果（F值和顯著性）Tab.2 The data on three-way ANOVA of phenolic acids in the roots of R.pseudoacacia seedlings

2.2 大氣CO2濃度升高和土壤Cd污染耦合對幼苗根系幾種酚酸單體化合物積累的影響

根系中共檢出沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸6類酚酸單體.由圖2可知，根系咖啡酸積累最多，對香豆酸積累最少，且對羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸隨幼苗生長時間的延長積累量降低，而沒食子酸、綠原酸和咖啡酸卻表現(xiàn)為增加.大氣CO2-Cd1和大氣CO2-Cd10處理下，沒食子酸、對羥基苯甲酸和咖啡酸積累在幼苗生長45和135 d時較大氣CO2-Cd0下顯著降低（P＜0.05），而90 d時，Cd1處理下較大氣CO2-Cd0下顯著增加（P＜0.05）；綠原酸積累在幼苗生長45 d時顯著降低（P＜0.05），而90 d時大氣CO2-Cd1處理顯著促進了綠原酸的積累；阿魏酸在幼苗生長45和135 d時大氣CO2-Cd1處理促進了其積累，而90 d時卻降低.耦合處理下，沒食子酸和綠原酸較大氣CO2-Cd0下顯著增加（P＜0.05），而其他酚酸積累在幼苗不同生長時間表現(xiàn)不同.高濃度CO2-Cd1和高濃度CO2-Cd10下沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸積累在幼苗生長135 d時均較大氣CO2-Cd1和大氣CO2-Cd10處理下顯著升高（P＜0.05），總體上根系不同種類酚酸積累在耦合條件和單一Cd處理下差異顯著（P＜0.05），但未表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律.此外，CO2、Cd及生長時間對根系酚酸單體含量的單一及交互作用顯著（P＜0.05）（表2）.

圖2 不同處理下刺槐幼苗根系幾種酚酸單體的含量Fig.2 The content of phenolic acid monomers in the roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

2.3 幼苗根系酚酸含量與其Cd含量的關(guān)系

根據(jù)已報道研究的根系Cd含量數(shù)據(jù)（表3），分析其對根系酚酸積累的影響.通過對各酚酸單體與根系Cd含量的皮爾遜相關(guān)分析表明，刺槐幼苗根系總酚酸、沒食子酸、綠原酸和咖啡酸積累和根系Cd含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而對香豆酸和阿魏酸積累和根系Cd含量呈顯著正相關(guān)，但對羥基苯甲酸的積累和根系Cd含量相關(guān)性不顯著（表4）.

表3 不同處理下幼苗根系Cd含量（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差）［22］Tab.3 The content of Cd in roots of R.pseudoacacia seedlings under different treatments

表4 刺槐幼苗根系酚酸與根系Cd含量的皮爾遜相關(guān)分析結(jié)果Tab.4 The Pearson correlation analysis between phenolic acids in roots of R.pseudoacacia seedlings and Cd in the roots

3 討論

3.1 大氣CO2濃度升高對幼苗根系酚酸含量的影響

由結(jié)果可知，大氣CO2濃度升高對刺槐幼苗根系總酚酸和幾種酚酸單體含量影響顯著.總體上，總酚酸和沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸和咖啡酸的積累對大氣CO2濃度升高的響應(yīng)規(guī)律相似，而對香豆酸和阿魏酸的積累對CO2濃度升高的響應(yīng)規(guī)律不同，表明刺槐根系不同種類酚酸的合成對大氣CO2濃度升高的響應(yīng)存在差異性.就測定的幾種酚酸來看，咖啡酸對總酚酸積累的貢獻最大，且是刺槐根系合成的主要單體酚酸，而阿魏酸是合成量最少的酚酸.此外，總酚酸含量隨幼苗生長時間的延長表現(xiàn)出顯著增加現(xiàn)象，沒食子酸、綠原酸和咖啡酸也表現(xiàn)出了類似的規(guī)律，表明大氣CO2濃度升高對刺槐根系酚酸合成的影響存在時間效應(yīng)，這可能與幼苗在不同生長時間段其酚酸的合成代謝支路及合成量不同有關(guān).此外，已有研究表明，大氣CO2濃度升高會顯著提高植物光合產(chǎn)物產(chǎn)量［23-24］，由此會提高光合產(chǎn)物分配到次生代謝物合成途徑的比例［24］，從而根系的次生代謝物分配比例亦會增加，故大氣CO2濃度升高下根系總酚酸和咖啡酸等幾種酚酸單體合成量的增加可能與刺槐幼苗生物量的增加有關(guān)［22］.此外，幼苗生長時間和CO2對酚酸積累的顯著交互作用表明大氣CO2濃度升高和幼苗生長時間對根系酚酸合成表現(xiàn)出了相互調(diào)節(jié)作用.

3.2 土壤Cd污染對幼苗根系酚酸積累的影響

重金屬脅迫下，根系通過調(diào)整次生代謝物的合成以緩解重金屬的毒害作用.研究表明Cd脅迫會損傷植物細(xì)胞清除自由基的能力，由此植物會合成酚酸等次生代謝物以緩減自由基帶來的細(xì)胞膜損傷［4］，而合成量的增加會提高根系的分配比例，從而會增加根系酚酸的含量.由皮爾遜相關(guān)分析結(jié)果可知根系總酚酸及除對羥基苯甲酸外的幾種單體酚酸積累呈顯著相關(guān)性.然而，除對香豆酸和阿魏酸外，總酚酸、咖啡酸、對羥基苯酸、綠原酸和沒食子酸積累都與根系Cd含量呈顯著負(fù)相關(guān).表明Cd對刺槐幼苗根系這幾種酚酸合成的誘導(dǎo)效應(yīng)較弱；而對香豆酸和阿魏酸與根系Cd含量的顯著正相關(guān)表明Cd對這兩種酚酸的合成具有明顯誘導(dǎo)作用，盡管兩種酚酸的合成量較低，但可能對協(xié)助幼苗抵抗Cd對其根系的過氧化損傷中起重要作用.此外，Cd與幼苗生長時間對根系酚酸積累的顯著交互作用也暗示了土壤Cd污染對幼苗根系酚酸合成的影響可能會隨生長時間的延長而加強.

3.3 大氣CO2濃度升高與Cd污染耦合對幼苗根系酚酸積累的影響

耦合條件下總酚酸與沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸的變化規(guī)律相同，表明Cd污染下這幾種酚酸的合成對大氣CO2濃度升高的響應(yīng)規(guī)律相似，而這種響應(yīng)與CO2濃度升高下根系Cd濃度較單一Cd污染下降低有關(guān)，相關(guān)性分析結(jié)果也表明了這點，且沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸在耦合條件下對幼苗的抗性調(diào)節(jié)具有重要作用，因而合成量會增加.此外，幼苗生長135 d時，大氣CO2濃度升高顯著降低了Cd處理下綠原酸、對羥基苯甲酸和咖啡酸的含量，表明土壤Cd污染下根系這幾種酚酸的合成隨著幼苗生長時間的延長，表現(xiàn)出了對大氣CO2濃度升高適應(yīng)的現(xiàn)象，此時幼苗的其他抗性系統(tǒng)如抗氧化酶可能起主要的抗氧化作用［4-7］.而CO2、Cd和時間對根系酚酸的顯著交互作用表明CO2濃度升高和Cd污染耦合對幼苗酚酸合成的調(diào)節(jié)作用受幼苗生長時間影響顯著.

4 結(jié)論

1）根系總酚酸、綠原酸和咖啡酸含量隨幼苗生長時間的延長而增加，而對羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸含量隨幼苗生長時間的延長表現(xiàn)為降低現(xiàn)象.

2）整體上，隨著刺槐幼苗生長時間的延長，大氣CO2濃度升高促進了土壤Cd污染下根系總酚酸、沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸的合成，降低了咖啡酸和綠原酸的合成量.

3）大氣CO2濃度升高與土壤Cd污染耦合條件下刺槐幼苗根系酚酸的合成與CO2濃度升高對根系Cd吸收的影響顯著相關(guān)，且根系除了抗氧化酶系統(tǒng)外，可能主要通過合成沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸來抵抗Cd的毒性損傷.