劉丘崗

肺癌患病率逐年增加，且具有極高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是其主要病理類型之一[1]。當(dāng)下臨床治療肺癌患者的措施諸多，然而尚未發(fā)現(xiàn)可有效根治該疾病的手段，患者5年生存率極低[2]。臨床實(shí)踐證實(shí)，盡管肺癌患者在早期診斷后得到有效的外科治療，但其亦可出現(xiàn)繼發(fā)局部轉(zhuǎn)移或全身系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移，甚至導(dǎo)致死亡[3-4]。故探尋肺癌發(fā)病機(jī)制及相關(guān)基因?qū)﹃U明腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增殖具有重要價(jià)值。p53基因突變或失活在多類型癌癥起病及演變過(guò)程中占據(jù)重要地位，如其可在50%左右的癌癥中出現(xiàn)突變，并參與介導(dǎo)致癌信號(hào)[5]。p53是抑癌基因療法中至關(guān)重要的一部分，其已成為臨床實(shí)踐基因療法的主要試驗(yàn)基因之一[6]。殼寡糖水溶性良好，細(xì)胞親和性較強(qiáng)，同時(shí)亦可與器官組織相容，有報(bào)道顯示，其抗菌性、抗氧化性、抗癌作用顯著[7]。臨床研究證實(shí)，殼寡糖可促進(jìn)諸多細(xì)胞凋亡，但針對(duì)其在肺癌中的作用及其機(jī)制尚未完全揭示[8]。故本次研究基于p53介導(dǎo)自噬通路，旨在探討殼寡糖抑制肺癌細(xì)胞系惡性增殖的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、儀器

1.1.1 細(xì)胞株 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于沈陽(yáng)康沐瑞達(dá)生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 殼寡糖購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司；DMSO購(gòu)于北京伊塔生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；鼠抗Bcl-2、Bax、Survivin抗體購(gòu)于艾美捷科技有限公司；DAB顯色劑購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 儀器 熒光顯微鏡購(gòu)于廣州科適特科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于普邁精醫(yī)科技(北京)有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)于上海輔澤商貿(mào)有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)于上海土森視覺(jué)科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于北京安麥格貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549置于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，然后放入CO2培養(yǎng)箱中孵育。密切關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 細(xì)胞分組 將A549細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、殼寡糖低濃度組、殼寡糖中濃度組、殼寡糖高濃度組，并分別予以0、1、2、5 mg·ml-1殼寡糖處理24 h。

1.2.3 MTT法測(cè)定A549細(xì)胞增殖能力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔6×103個(gè)細(xì)胞植于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，然后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于24 h、48 h、72 h時(shí)向每孔中加入20 μl 5.0 mg·ml-1MTT，4 h后置于離心機(jī)中以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心10 min，棄上清液并于每孔中加入150 μl DMSO，震蕩15 s后于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度值，同時(shí)分析其增長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞增長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.2.4 Hoechst染色法測(cè)定A549細(xì)胞凋亡形態(tài) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，并將其濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，同時(shí)植于6孔板中，常規(guī)孵育24 h，待其貼壁后經(jīng)0.25%胰酶消化、離心機(jī)離心后收集細(xì)胞。取提前冷處理的Buffer A沖洗3次并轉(zhuǎn)至新的無(wú)菌EP管中，加入1 ml 4%甲醛固定液固定15 min，再次離心并棄上清液，采用Buffer A沖洗3次重懸細(xì)胞。將2滴細(xì)胞懸液加于載玻片中央制備細(xì)胞涂片，并放在室溫下自然風(fēng)干。加2滴Hoechst 33258工作液于圖片，在室溫下封閉反應(yīng)15 min，然后采用蒸餾水沖洗，于紫外光波長(zhǎng)340 nm處激發(fā)，并于顯微鏡下觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定A549細(xì)胞凋亡率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，并將其濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，同時(shí)植于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)孵育24 h，采用0.25%胰酶進(jìn)行常規(guī)消化，并放在離心機(jī)以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心10 min，吸棄上清液后取 PBS液重懸細(xì)胞，再次放入離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)的速度離心10 min，棄上清液后加入結(jié)合緩沖液及5 μl Annexin V-FITC，輕輕晃動(dòng)使其充分混勻，放在室溫下自然孵育15 min，離心棄上清液；加入10 μl碘化丙啶輕輕晃動(dòng)并使其充分混勻，于室溫下孵育15 min采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 western blot檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[Bcl-2、Bax、生存素(Survivin)]及p53(p53、p-p53)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞提取總蛋白，同時(shí)應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)其蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色后進(jìn)行顯影及定影，然后采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，最后對(duì)圖像進(jìn)行分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的作用

在24 h、48 h、72 h時(shí)，殼寡糖濃度組A549細(xì)胞系增殖抑制率較陰性對(duì)照組顯著升高，且呈時(shí)間濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 殼寡糖對(duì)A549細(xì)胞凋亡能力的作用

殼寡糖濃度組A549細(xì)胞凋亡率較陰性對(duì)照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表2。陰性對(duì)照組A549細(xì)胞染色較淡，表現(xiàn)為暗藍(lán)色；殼寡糖濃度組A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，出現(xiàn)核固縮、變小、核碎裂等現(xiàn)象，且和染色較深，表現(xiàn)為亮藍(lán)色，同胞內(nèi)及胞周存在顆粒狀深染物質(zhì)。

表2 各組A549細(xì)胞凋亡率比較

2.3 殼寡糖對(duì)A549細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

殼寡糖濃度組A549細(xì)胞Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A為陰性對(duì)照組；B：殼寡糖低濃度組；C為殼寡糖中濃度組；D為殼寡糖高濃度組； a表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與殼寡糖低濃度組相比，P<0.05；c表示與殼寡糖中濃度組相比，P<0.05。

2.4 殼寡糖對(duì)A549細(xì)胞p53信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

殼寡糖濃度組A549細(xì)胞中p53、p-p53、beclin 1蛋白表達(dá)水平陰性對(duì)照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

殼寡糖由甲殼素脫乙?；⒔到馑?，易被人體吸收。Xu[9]研究表明，殼寡糖在肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、等腫瘤中發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用，然而該過(guò)程涉及方面諸多，十分復(fù)雜。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示，殼寡糖抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡及壞死實(shí)現(xiàn)的[10]。Pae等[11]研究證實(shí)，殼寡糖既可阻斷人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60生長(zhǎng)，亦可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，且該過(guò)程中存在細(xì)胞周期異常。但目前針對(duì)p53介導(dǎo)的自噬通路在肺癌細(xì)胞系中的作用及其機(jī)制尚未有研究進(jìn)行探究，因此本研究將進(jìn)一步進(jìn)行分析。

A為陰性對(duì)照組；B為殼寡糖低濃度組；C為殼寡糖中濃度組；D為殼寡糖高濃度組； a表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與殼寡糖低濃度組相比，P<0.05；c表示與殼寡糖中濃度組相比，P<0.05。

本次研究中我們分別于不同時(shí)間段采用MTT法對(duì)各組A549細(xì)胞增值抑制率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間段內(nèi)殼寡糖濃度組A549細(xì)胞系增殖抑制率較陰性對(duì)照組顯著升高。此外我們亦采用Hoechst染色及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡率進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)殼寡糖濃度組A549細(xì)胞凋亡較陰性對(duì)照組顯著升高，殼寡糖濃度組A549細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，表現(xiàn)為亮藍(lán)色，且殼寡糖濃度為5.0 mg·ml-1時(shí)細(xì)胞增殖抑制作用及促凋亡作用最顯著。以上結(jié)果提示殼寡糖抗腫瘤效果顯著。Bcl-2可有效抑制細(xì)胞凋亡能力，主要是通過(guò)阻斷Bax及Bak活性進(jìn)行的。Survivin可發(fā)揮腫瘤特異性，且在癌細(xì)胞即胚胎組織中存在表達(dá)。董永強(qiáng)等[12]研究證實(shí)，Survivin可作為半胱天冬氨酶-3、半胱天冬氨酶-7直接阻斷劑進(jìn)而抑制諸多因素刺激產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)，亦可與周期相關(guān)蛋白激酶相互作用發(fā)揮凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，殼寡糖濃度組A549細(xì)胞Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組顯著升高，且呈濃度依賴性。提示殼寡糖抗促凋亡作用可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)及下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)進(jìn)行的，而肺癌細(xì)胞增殖抑制作用可能是通過(guò)阻斷半胱天冬氨酶家族抑制劑Survivin表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，可為殼寡糖抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。針對(duì)p53抗腫瘤生物學(xué)作用主要由兩方面入手，一是其可阻斷細(xì)胞分裂過(guò)程，將細(xì)胞阻滯于G1期繼而發(fā)揮抗腫瘤作用；二是p53可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬發(fā)揮抗腫瘤作用，其中后者是p53阻斷腫瘤生物學(xué)功能的主要通路，阻斷腫瘤進(jìn)展效果顯著。beclin 1是1種具有抗腫瘤作用的自噬相關(guān)調(diào)節(jié)基因，其抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬及凋亡達(dá)到阻斷腫瘤進(jìn)展的目的[13-14]。王文玉等[15]研究證實(shí)，beclin 1可明顯阻斷體外A549細(xì)胞系及裸鼠體內(nèi)A549細(xì)胞系增殖能力，而應(yīng)用藥物可促進(jìn)自噬發(fā)生，可在一定程度上增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放化療敏感性。殼寡糖濃度組A549細(xì)胞中p53、p-p53、beclin 1蛋白表達(dá)水平陰性對(duì)照組顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。提示殼寡糖可通過(guò)調(diào)控p53介導(dǎo)的自噬通路進(jìn)而上調(diào)p53、p-p53、beclin 1蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)肺癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，殼寡糖可抑制肺癌細(xì)胞系惡性增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)Bcl-2、Survivin、Bax表達(dá)及p53介導(dǎo)的自噬通路實(shí)現(xiàn)的。