李沅澤，李保華，王彩霞

(青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院/山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109)

蘋果輪紋病(Apple ring rot)又被稱為蘋果粗皮病、輪紋爛果病，是蘋果生產(chǎn)中危害最為嚴重的病害之一。20世紀90年代以來，隨蘋果產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，感病品種‘富士’的栽培面積不斷擴大。目前，蘋果輪紋病在我國各個蘋果主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，對全國7省市蘋果園的調查結果顯示，枝干的總體發(fā)病率達77.6%。一般年份，套袋果實輪紋病發(fā)病率15%～20%，顯著降低了蘋果的產(chǎn)量和質量，嚴重制約了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。

近年來，對蘋果輪紋病的流行規(guī)律、防治技術及病原學等進行了系統(tǒng)研究，對該病原菌有了更深入的了解[3]。已明確我國輪紋病的病原菌為Botryosphaeriadothidea，探明輪紋病菌侵染枝干和果實的途徑、癥狀及發(fā)展動態(tài)。‘富士’果實自幼果期至采收期都可感染輪紋病，其中6-8月果實對輪紋病菌最敏感，而侵染果實的病原菌全部來自枝干[4-5]。目前，生產(chǎn)上主要采用套袋栽培的方法，保護果實免受輪紋病菌侵染，隨著套袋成本逐年升高，使得無袋栽培成為必然趨勢[2, 6]。蘋果輪紋病的防控目前尚無針對性措施，其中一個重要原因是對輪紋病菌的致病機理缺少全面深入的了解。

細胞壁降解酶作為多種植物病原真菌的重要致病因子，在病原菌侵染寄主過程中扮演著重要的角色[7-8]。陳曉林等[9]報道蘋果樹腐爛病菌致病過程中可產(chǎn)生5種細胞壁降解酶，其中木聚糖酶對蘋果組織的浸解能力最強；李超等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腐爛病菌分泌細胞壁降解酶活性與菌株致病力呈正相關。層生鐮刀菌可引起多種植物病害，強致病力菌株可分泌多種細胞壁降解酶，包括漆酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶等；最近，Sharafaddin等[11-12]證實層生鐮刀菌不同致病力菌株產(chǎn)生纖維素酶的量與其定殖能力密切相關，表明細胞壁降解酶是該病菌的主要致病因子。蘋果輪紋病菌侵染后的果實表現(xiàn)出典型的細胞壁降解癥狀，推測酶類物質在病原菌的侵染過程中發(fā)揮重要作用，但目前關于輪紋病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶種類及其活性變化等研究尚未見報道。本研究測定了蘋果輪紋病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶的種類，分析了5種碳源誘導輪紋病菌體外產(chǎn)生細胞壁降解酶的效果，及其在寄主體內分泌的細胞壁降解酶的活性變化趨勢，以期明確蘋果樹輪紋病菌的致病因子，為病害有效防控提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與植物材料

蘋果輪紋病菌菌株LXS030101分離自發(fā)病‘富士’枝條，由本實驗室成員進行單孢分離、純化后鑒定為葡萄座腔菌(B.dothidea)[4]。

供試植物材料為2～3年生‘富士’蘋果枝條和6月份幼果，均采集自青島農(nóng)業(yè)大學試驗田。成熟‘富士’果實采集自商品果園。

1.2 供試培養(yǎng)基

蘋果輪紋病菌細胞壁降解酶的誘導方法參照Dipietro等[13]報道稍做改進，以改良的Fries培養(yǎng)基(酒石酸銨5 g，硝酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.1 g，酵母提取物1 g)為基本培養(yǎng)基，分別添加5種不同的碳源: 蔗糖(Sucrose)20 g，木聚糖(Xylan) 2 g，果膠(Pectin) 5 g，羧甲基纖維素鈉(CMC) 10 g，木葡聚糖(Xyloglucan) 2 g，用蒸餾水定容至1 L，自然pH。

上述培養(yǎng)基均按60 mL/150 mL的裝瓶量進行分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.3 細胞壁降解酶的體外誘導和菌絲干重測定

將蘋果輪紋病菌培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，25 ℃，暗培養(yǎng)3 d。在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，接種于上述5種不同碳源液體培養(yǎng)基，每瓶接種4個菌餅，于25 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于12、24、48、72、96、120 h進行取樣，以未接種輪紋病菌的各培養(yǎng)基作為對照，每處理3個重復。培養(yǎng)液用濾紙過濾后，于4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液進行酶活性的測定。于120 h取樣后，收集菌絲置于50 ℃烘箱，烘干后測量菌絲干重。

1.4 蘋果果實和枝條接種及粗酶液的制備

選取顏色、大小相近且無傷痕病斑的健康成熟果實和幼果，自來水洗凈后，用75%酒精進行果實表面消毒。待果實晾干后，用直徑6 mm打孔器造成傷口，深度約3 mm，接種輪紋病菌菌餅后放入密封保濕盒。蘋果離體枝條接種采用燙傷接種法，均于25 ℃條件下進行暗培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h觀察測量病斑，并切取病健交界處果實組織，放置于-80 ℃保存，用于細胞壁降解酶活性測定。以未接種病原菌的果實和枝條作為對照，每處理設置3個重復。

每克鮮重組織加入25 mL提取液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，2% PVP，0.5% Triton X-100，pH值7.2)，冰浴振蕩40 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后上清液即為粗酶液。

1.5 細胞壁降解酶活性測定

采用紫外-可見光分光光度法測定細胞壁降解酶的活性。多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、內切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)、木葡聚糖酶(Xyloglucanase)、木聚糖酶(Xylanase)和濾紙酶(FPA)的活性測定參考李寶聚、Douaiher和Siah等[14-16]報道，利用二硝基水楊酸(DNS)在540 nm處測定反應混合物的消光值，根據(jù)酶反應所釋放的還原糖量計算酶活性。PG和PMG所用底物為0.5%多聚半乳糖醛酸溶液和0.25%橘皮果膠溶液，EG和β-葡萄糖苷酶活性測定所用底物為1% CMC溶液和0.5%水楊苷溶液，木葡聚糖酶和木聚糖酶底物為0.2%木葡聚糖溶液和0.25%木聚糖溶液，濾紙酶底物為新華一號定量濾紙。50 ℃條件下每分鐘每毫升酶液(每克組織鮮重)催化底物釋放1 μmol還原糖為一個酶活單位，用U/mL或U/g表示。

多聚半乳糖醛酸酶反式消除酶(PGTE)和果膠甲基反式消除酶(PMTE)的活性測定參照文獻報道，在232 nm處測定反應混合物消光值，按相應公式計算酶活性[14]。30 ℃下每分鐘每毫升酶液催化底物釋放1 μmol不飽和醛酸為一個酶活單位(U/mL)。最終計算樣品酶活性均減去對照值加以校正。

2 結果與分析

2.1 蘋果輪紋病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶種類和水平

輪紋病菌活化后接種蔗糖作碳源的培養(yǎng)基，同時接種蘋果成熟果實，分別對9種細胞壁降解酶進行活性測定。表1結果顯示，在蔗糖培養(yǎng)基和發(fā)病果實中均未檢測到PGTE和PMTE酶活性，但其余7種酶活性均有不同程度升高，表明輪紋病菌可產(chǎn)生多種細胞壁降解酶且酶活性存在差異。在蔗糖培養(yǎng)基中，輪紋病菌產(chǎn)生的PG酶活性最高，其次為PMG、β-葡萄糖苷酶、木葡聚糖酶和FPA，而木聚糖酶活性最低；在成熟果實中，該病菌分泌的木聚糖酶活性最低，其余各酶活性相當。此外，蔗糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的各細胞壁降解酶活性均高于成熟果實，然而，在發(fā)病蘋果枝條組織中，上述各細胞壁降解酶活性均未檢測到。

表1 輪紋病菌在蔗糖培養(yǎng)基和蘋果果實中產(chǎn)生細胞壁降解酶活性

2.2 不同碳源培養(yǎng)條件下輪紋病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶活性

分別以蔗糖、果膠等為碳源對輪紋病菌進行培養(yǎng)，于培養(yǎng)后24～96 h取樣，測定7種細胞壁降解酶活性，結果見圖1。輪紋病菌在5種碳源培養(yǎng)條件下，僅在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中檢測到木聚糖酶，培養(yǎng)48 h時酶活性水平最高為3.96 U/mL，而在其他4種碳源培養(yǎng)條件下均未檢測到木聚糖酶活性。同樣，蔗糖為碳源時誘導輪紋病菌產(chǎn)生的木葡聚糖酶、PMG、EG、β-葡萄糖苷酶和FPA酶活性均顯著高于其他碳源，且最大酶活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液中。以果膠為碳源時，可誘導輪紋病菌產(chǎn)生高活性的PG，酶活性達39.62 U/mL；以木葡聚糖為碳源時，產(chǎn)生的PG酶活性也最高，但僅為3.94 U/mL。以CMC為碳源時，誘導病菌產(chǎn)生的PMG酶活性最高，而β-葡萄糖苷酶活性最低。以木聚糖為碳源時，誘導輪紋病菌產(chǎn)生的各細胞壁降解酶活性均較低且達到酶活性峰值時間較晚(培養(yǎng)72～96 h)。

圖1 5種碳源培養(yǎng)條件下蘋果輪紋病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶活性

試驗測定了蔗糖、CMC、果膠、木聚糖和木葡聚糖5種碳源條件下，培養(yǎng)120 h后，蘋果輪紋病菌的菌絲干重。圖2結果顯示，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，蘋果輪紋病菌生長最快，菌絲干重達0.18 g，其次為以果膠和木聚糖為碳源的培養(yǎng)基，而在木葡聚糖為碳源的培養(yǎng)基中長最慢，菌絲干重僅為0.05 g。

圖2 不同碳源培養(yǎng)條件下蘋果輪紋病菌的菌絲干重

2.3 蘋果輪紋病菌侵染果實過程中產(chǎn)生細胞壁降解酶的活性變化規(guī)律

蘋果輪紋病菌侵染成熟果實過程中，可產(chǎn)生7種細胞壁降解酶，其活性變化如圖3A所示。輪紋病菌分泌的木聚糖酶僅在接種后72 h檢測到活性升高； PG、PMG、木葡聚糖酶和FPA酶活性變化趨勢一致，均在接種后24 h出現(xiàn)一個明顯的低谷，隨后酶活性顯著升高。β-葡萄糖苷酶活性于接種后24 h即到達峰值為11.72 U/g，隨后酶活性快速降低，接種后72 h甚至未檢測到該酶活性。EG酶活性呈現(xiàn)先升高后減低的單峰曲線，于接種后48 h到達高峰(5.20 U/g )。

相比成熟果實，輪紋病菌在侵染蘋果幼果過程中產(chǎn)生的細胞壁降解酶種類減少，且酶活性水平均較低(圖3B)。幼果接種輪紋病菌后，僅產(chǎn)生6種細胞壁降解酶，均未檢測到木聚糖酶活性。PG和β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的單峰曲線，于接種后48 h酶活性達到峰值分別為3.23 U/g 和1.41 U/g ；PMG酶活性僅在接種后24 h和48 h產(chǎn)生，木葡聚糖酶活性在接種后24～72 h產(chǎn)生，兩者均于接種后48 h到達最高酶活性水平；EG酶活性僅在侵染早期(接種后12～24 h)產(chǎn)生，而FPA酶活性于接種后12 h已到達活性高峰(2.30 U/g )，隨后酶活性水平緩慢降低。

輪紋病菌接種蘋果果實后病斑面積如圖4所示，成熟蘋果果實接種輪紋病菌后12 h即可觀察到明顯的發(fā)病癥狀，接種點周圍出現(xiàn)褐色、水漬狀、軟腐病斑，隨后病斑快速擴展；接種后48 h時，病斑面積已達4.48 cm2；接種后72 h時，病斑上有褐色黏液滲出，病斑面積達13.06 cm2。幼果接種蘋果輪紋病菌后24 h開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種點周圍果肉組織變褐，隨后病斑緩慢擴展，病組織未表現(xiàn)水漬狀，接種后72 h時病斑面積僅為2.41 cm2。

圖3 蘋果輪紋病菌侵染成熟果實(A)和幼果(B)產(chǎn)生細胞壁降解酶活性變化

圖4 蘋果輪紋病菌接種成熟果實和幼果后病斑面積變化

3 討論

本研究對蘋果輪紋病菌分泌的細胞壁降解酶種類和活性進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)該病菌在液體培養(yǎng)基和侵染成熟果實過程中均能產(chǎn)生PG、PMG、EG等7種細胞壁降解酶；在侵染幼果時未檢測到木聚糖酶，僅產(chǎn)生6種細胞壁降解酶。然而，在發(fā)病蘋果枝條中均未檢測到上述細胞壁降解酶，說明該病菌侵染機制非常復雜，除細胞壁降解酶外存在其他重要的致病因子。Reveglia等[17]報道，葡萄座腔菌在致病過程中，可產(chǎn)生二丙烯酸(spencertoxin)、蜂蜜曲霉素(mellein)及其衍生物等多種毒素，但輪紋病菌產(chǎn)生的毒素種類及作用機制等尚不清楚。

利用5種碳源均可誘導蘋果輪紋病菌產(chǎn)生多種細胞壁降解酶，但在蔗糖培養(yǎng)基中分泌的細胞壁降解酶活性和種類顯著大于其他4種碳源，且輪紋病菌在此培養(yǎng)基中生長量最大，說明該病菌產(chǎn)生細胞壁降解酶活性與菌絲生長呈正相關。Ramos等[18]研究發(fā)現(xiàn)，玉米碳腐病菌在果膠作為碳源時，可產(chǎn)生高活性的PG和PMG且出現(xiàn)時間較早，而在CMC作為碳源時，誘導該病原菌產(chǎn)生的纖維素酶活性較低且出現(xiàn)時間較晚。本研究中輪紋病菌在果膠培養(yǎng)基中分泌的PG和PMG最大酶活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液中，但PG酶活性(39.62 U/mL)顯著大于PMG酶活性(5.43 U/mL)；以CMC為碳源時，輪紋病菌產(chǎn)生的兩種纖維素酶(β-葡萄糖苷酶和FPA)活性均較低，且出現(xiàn)時間較晚，說明不同病原菌在不同碳源誘導條件下，產(chǎn)生細胞壁降解酶活性變化存在明顯差異。

木聚糖酶是多種植物病原真菌的重要致病因子，已有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病菌木聚糖酶基因VmXyl1敲除后，突變體致病力顯著降低；灰葡萄孢菌木聚糖酶基因xyn11A缺失突變體對番茄和葡萄漿果的致病力降低70%[19-20]。然而，輪紋病菌僅在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中分泌木聚糖酶，且酶活性較低，該病原菌侵染果實過程中，僅在接種后72 h的成熟果實中檢測到木聚糖酶活性，說明木聚糖酶可能不是輪紋病菌的重要致病因子。

蘋果輪紋病菌在侵染果實過程中，可產(chǎn)生高活性的果膠酶(PG和PMG)，尤其在侵染幼果時，產(chǎn)生的PG酶活性顯著高于其他5種細胞壁降解酶，表明該酶在輪紋病菌致病過程中發(fā)揮重要作用。洪坤奇[21]利用基因敲除技術，獲得了輪紋病菌兩個果膠酶基因的缺失突變體△Bdpl1-3和△Bdpg1-2，發(fā)現(xiàn)其對蘋果果實的致病力均明顯降低，但△Bdpl1-3在蘋果枝條上的致病力無明顯變化，結合本研究結果，推測與輪紋病菌在蘋果枝條中不產(chǎn)生細胞壁降解酶有關。本研究發(fā)現(xiàn)，輪紋病菌有傷接種幼果后，病斑擴展緩慢，且未出現(xiàn)水漬狀、軟腐病斑，推測與其產(chǎn)生的細胞壁降解酶活性低有關，這與自然條件下，輪紋病菌侵染的幼果并不發(fā)病，待果實近成熟或儲藏期才開始發(fā)病的特點相一致[2]。

本研究測定了輪紋病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶在蘋果果實中的動態(tài)變化，在成熟果實中，PG、PMG、木葡聚糖酶和FPA在接種后12 h時酶活性水平較高，但于接種后24 h出現(xiàn)了一個明顯的低谷，而此時β-葡萄糖苷酶活性快速升高并達到峰值，說明輪紋病菌致病過程中各細胞壁降解酶存在協(xié)同作用，且有其他致病因子如毒素等的參與，哪種是關鍵致病因子及各致病因子間如何協(xié)調作用等，有待深入研究。