范錫同，閆思涵

(新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所 門診住院部，河南 新鄉(xiāng) 453000)

結(jié)核(tuberculosis，TB)系人體體抗力下降時(shí)，結(jié)核分支桿菌入侵所致的一類慢性、具有傳染性的疾病，該病的預(yù)防和診治乃全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。由于結(jié)核菌可侵犯機(jī)體全身不同器官，其中80%以上為肺部感染[3]，若發(fā)現(xiàn)為肺結(jié)核則可能需要借助影像檢查來(lái)鑒別結(jié)核與其他肺部病變[4]，TB患者確診后盡早進(jìn)行干預(yù)可確保治療徹底，因此，對(duì)于該類患者早期進(jìn)行準(zhǔn)確診斷十分關(guān)鍵。目前，在TB患者中采取的檢查主要包括X線檢查、涂片、結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(T-ELISPOT.tuberculosis，T-SPOT.TB)、卡介菌純蛋白衍生物(purified protein derivative of BCG，BCG-PPD)及結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD)等多種方式[5]。本研究選取90例疑似結(jié)核兒童為研究對(duì)象，探討T-SPOT.TB、BCG-PPD及TB-PPD在兒童TB病變中的診斷效能，期望為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年4月至2020年4月新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所檢查的90例疑似TB兒童為研究對(duì)象，其中男43例，女47例；年齡1個(gè)月～14歲，平均(7.23±3.26)歲，<5歲組(33例)和≥5歲組(57例)；臨床確診為TB病變患兒42例，非TB患兒48例(肺炎、腦膜炎、淋巴結(jié)炎、結(jié)腸炎等疾病患兒)。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①持續(xù)發(fā)熱及咳嗽2周以上；②應(yīng)用抗菌藥物后臨床癥狀無(wú)緩解；③與活動(dòng)性肺結(jié)核患者一同生活；④經(jīng)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD檢測(cè)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重器官功能障礙；②檢查禁忌；③合并基礎(chǔ)性疾??；④合并其他惡性腫瘤；⑤病例資料不全。

1.3 診斷方法

1.3.1T-SPOT.TB檢測(cè) 采用英國(guó)Oxford Immunotec公司所產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)，所有操作過(guò)程均依照說(shuō)明書嚴(yán)格執(zhí)行。采集2 mL被檢兒童外周血，以Ficoll Paque法提出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，將PBMC用AIM-V(美德太平洋生物科技股有限公司生產(chǎn))洗滌2次并稀釋成250 000/100 μL的工作液，分別向A、B培養(yǎng)孔加入50 μL A抗原(ESAT6)、B抗原(CFP10)，再將100 μL稀釋的工作液加入其中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的環(huán)境中培育16～20 h，孵化后用PBS洗滌4次并拍干板孔，然后再在每孔加進(jìn)50 μL二抗工作液放入4～8 ℃的環(huán)境下培育1 h，隨后再加入同樣劑量的顯色液，避光靜置5～10 min，干燥2 h顯色后觀察斑點(diǎn)數(shù)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照孔計(jì)數(shù)≤5，同時(shí)A/B孔與之計(jì)數(shù)之差≥6；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)計(jì)數(shù)是6～10，同時(shí)A或B孔計(jì)數(shù)值為其2倍及以上。否則為陰性。

1.3.2BCG-PPD、TB-PPD檢測(cè) BCG-PPD檢測(cè)采用的試劑為成都生物制品研究所有限公司所生產(chǎn)，每瓶1 mL，使用劑量為0.1 mL(50 UI BCG-PPD)，TB-PPD檢測(cè)所用的試劑是北京祥瑞生物制品有限公司所產(chǎn)，每瓶量及使用劑量均與BCG-PPD相同。兩種PPD用法均為在左前臂掌側(cè)中下位置1/3處皮內(nèi)注入，并在72 h后來(lái)院檢測(cè)入針位置的反應(yīng)情況，結(jié)果均采取硬結(jié)橫縱徑的毫米數(shù)為記錄標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)平均值≥5 mm即為陽(yáng)性，否則為陰性，若患兒注射后觀察到水皰、壞死、淋巴管炎等現(xiàn)象則屬于強(qiáng)陽(yáng)反應(yīng)，同時(shí)對(duì)其反應(yīng)情況做詳細(xì)注明。

1.3.3診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)2份痰或其他體液標(biāo)本，經(jīng)涂片檢查，結(jié)果顯示抗酸桿菌陽(yáng)性；(2)1份痰或其他體液標(biāo)本經(jīng)涂片檢查結(jié)果顯示抗酸桿菌陽(yáng)性，且具備肺結(jié)核胸部影像學(xué)特點(diǎn)；(3)1份痰或其他體液標(biāo)本經(jīng)涂片檢查顯示抗酸桿菌陽(yáng)性，且1份痰或其他體液經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)為陽(yáng)性、菌種為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；(4)具肺結(jié)核胸部影像學(xué)特點(diǎn)，且1份痰或其他體液標(biāo)本檢出分枝桿菌核酸結(jié)果陽(yáng)性；(5)病變組織病理學(xué)改變符合結(jié)合病理學(xué)特征。以上5項(xiàng)符合任意一項(xiàng)即可確診為肺結(jié)核。

1.4 觀察指標(biāo)(1)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD對(duì)兒童TB診斷的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值；(2)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD對(duì)以5歲為分界線的患兒TB病變的診斷靈敏度、特異度。

2 結(jié)果

2.1 3種檢查的診斷效能3種檢測(cè)方式在兒童TB中的診斷靈敏度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.533，P=0.038)，兩兩比較中T-SPOT.TB與BCG-PPD、TB-PPD比較靈敏度更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.200、6.158，P=0.040、0.013)，而BCG-PPD和TB-PPD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.207，P=0.649)；三者在兒童TB診斷方面的特異度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.189，P=0.027)，兩兩比較中T-SPOT.TB比BCG-PPD、TB-PPD有更高的特異度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(連續(xù)校正χ2=7.207、5.031，P=0.007、0.025)，而BCG-PPD和TB-PPD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.253，P=0.615)。3種檢測(cè)方法的檢查結(jié)果見表1。各種方法診斷兒童TB的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.073，P=0.964)；診斷兒童TB的陰性預(yù)測(cè)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.076，P=0.018)。兩兩比較中，T-SPOT.TB陰性預(yù)測(cè)值高于BCG-PPD、TB-PPD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.167、5.042，P=0.041、0.025)；BCG-PPD與TB-PPD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 3種檢查診斷結(jié)果分析

表2 3種檢查診斷效能分析(%)

2.2 3種檢查對(duì)<5和≥5歲TB患兒的診斷靈敏度、特異度T-SPOT.TB在≥5歲組兒童結(jié)核中的診斷靈敏度為93.10%，高于<5歲組(69.23%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種檢測(cè)方式診斷<5歲組兒童TB的靈敏度和特異度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3種檢測(cè)方式診斷≥5歲組兒童TB的靈敏度和特異度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較中，T-SPOT.TB較BCG-PPD及TB-PPD有更高靈敏度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正χ2=4.039、4.039，P=0.044、0.044)；T-SPOT.TB的特異度較BCG-PPD、TB-PPD更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023、0.023)。見表3、4。

表3 3種檢查對(duì)<5歲和≥5歲TB患兒的診斷靈敏度比較[%(n/N)]

表4 3種檢查對(duì)<5歲和≥5歲TB患兒的診斷特異度比較[%(n/N)]

3 討論

伴隨環(huán)境的改變以及艾滋病的傳播，TB的發(fā)病率逐漸增高，多數(shù)患者發(fā)病過(guò)程較緩慢，僅少數(shù)患者感染后起病表現(xiàn)較急[6]。由于不同患者結(jié)核菌的入侵部位不盡相同，患者的表現(xiàn)也存在相應(yīng)差別，較多的肺結(jié)核患者發(fā)病后可無(wú)明顯癥狀，隨著病變的進(jìn)展也可伴有發(fā)熱、乏力、咳嗽等癥狀[7]；其他部位的結(jié)核患者臨床表現(xiàn)不一，早期癥狀較輕或不明顯，部分胃部結(jié)核者可存在類似胃炎或潰瘍等癥狀，腹部出現(xiàn)疼痛感，肝臟與腸結(jié)核者多表現(xiàn)為發(fā)熱與乏力，還有部分會(huì)出現(xiàn)食欲衰減、消化道癥狀等，因此，臨床常常需要根據(jù)不同TB患者的病因、表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查來(lái)作出診斷和評(píng)估[8]。對(duì)于TB患者而言，在早期檢查確診后應(yīng)進(jìn)一步判斷其結(jié)核類型以及病情進(jìn)展，明確患者肺部及其他部位的結(jié)核活動(dòng)性，而后遵循盡早采取措施、用藥適量、聯(lián)合治療、規(guī)律用藥及全程堅(jiān)持的原則對(duì)TB患者進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到最好治療效果[9]。在兒童這一特殊人群中，TB患兒的最主要表現(xiàn)是低熱以及結(jié)核中毒，若呼吸系統(tǒng)有癥狀則可能為病情發(fā)展較為嚴(yán)重，由于X線具有一定的電離輻射，對(duì)于年齡較小疑似TB的患兒，應(yīng)盡量減少該方式的檢查次數(shù)，可在其他檢查確診后采取該技術(shù)已確定結(jié)核的具體位置、活動(dòng)及進(jìn)展等，因此，本研究對(duì)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD 3種診斷方式進(jìn)行了探討和分析。

機(jī)體感染結(jié)核病后，體內(nèi)會(huì)有記憶T細(xì)胞生成，若該種細(xì)胞后續(xù)受到抗原刺激即可被激活，釋放出干擾素-γ，T-SPOT.TB則是利用特異性抗原(ESAT6、CFP10)來(lái)刺激T細(xì)胞，通過(guò)酶聯(lián)顯色后再計(jì)出斑點(diǎn)數(shù)判別被檢者有無(wú)結(jié)核感染。BCG-PPD為卡介菌培養(yǎng)液提取的蛋白質(zhì)的稀釋制劑，TB-PPD為從人型結(jié)核桿菌內(nèi)提出的純蛋白，可對(duì)卡介苗接種對(duì)象注射該兩種試劑監(jiān)測(cè)其機(jī)體免疫反應(yīng)，也可對(duì)疑似TB患者注射該兩類試劑觀察其皮膚反應(yīng)以判別出被注射對(duì)象體內(nèi)有無(wú)結(jié)核桿菌存在。劉珍敏等[10]研究顯示，T-SPOT.TB對(duì)TB的診斷特異性達(dá)到95%以上，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的被檢者基本可判斷為TB患者，本研究中，90例疑似TB的兒童均接受上述3種檢測(cè)，T-SPOT.TB的診斷靈敏度、特異度在3種檢測(cè)方式中均最高，且本研究中T-SPOT.TB對(duì)兒童TB的診斷特異度為95.83%，提示T-SPOT.TB與另外兩種檢測(cè)方式比較，有更高的真實(shí)性，與上述文獻(xiàn)結(jié)論有較高的一致性。劉思景等[11]研究指出，T-SPOT.TB對(duì)5歲以上TB兒童的診斷有更大的優(yōu)勢(shì)，而在5歲以下患兒中的診斷則有不確定性，建議聯(lián)合其他檢測(cè)方法進(jìn)行診斷，以提高幼小兒童TB的診斷準(zhǔn)確率。本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，T-SPOT.TB在≥5歲兒童中診斷TB的靈敏度為93.10%，較<5歲組明顯升高，與上述文獻(xiàn)觀點(diǎn)一致，而與BCG-PPD和TB-PPD兩種檢測(cè)方式比較，也明顯更高；T-SPOT.TB對(duì)≥5歲兒童TB診斷的靈敏度則可達(dá)到100%。這說(shuō)明該檢測(cè)方式對(duì)≥5歲兒童的診斷更加準(zhǔn)確，當(dāng)≥5歲兒童的檢測(cè)結(jié)果呈陰性時(shí)，可排除TB病變情況，可能是年齡較小的幼兒體內(nèi)淋巴細(xì)胞與結(jié)核桿菌抗原的反應(yīng)能力相對(duì)更弱，加上其免疫系統(tǒng)不夠完善，感染后易轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)性TB，但該技術(shù)在<5歲組兒童中的診斷特異度也達(dá)到90%，也可作為年齡較小的幼兒診斷TB的技術(shù)之一。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測(cè)在TB患兒中的診斷有較高的應(yīng)用價(jià)值，可作為疑似結(jié)核兒童早期就診速篩查的檢測(cè)技術(shù)，值得臨床應(yīng)用。本研究局限為樣本量較少，患兒接受檢測(cè)后未進(jìn)行隨訪，缺少兒童接受不同檢測(cè)技術(shù)時(shí)不良反應(yīng)的發(fā)生情況，故今后還需進(jìn)一步實(shí)施大樣本量以及不同檢測(cè)技術(shù)在兒童應(yīng)用中的不良反應(yīng)發(fā)生情況的研究和分析。