張琴 張花梅

濱州市中心醫(yī)院婦科，山東 251700

宮頸癌是臨床婦科常見的惡性腫瘤，在我國的發(fā)生率非常高，近幾年呈年輕化趨勢［1］。宮頸癌發(fā)生、發(fā)展與上皮細(xì)胞血管生成、不典型增生有很大的關(guān)系。酸性成纖維細(xì)胞生長因子（aFGF）與堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）在促進(jìn)細(xì)胞生成、血管生成、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌發(fā)展期間發(fā)揮著重要的作用［2］。但是，臨床關(guān)于aFGF、bFGF在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)研究較少，本研究主要是對(duì)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中aFGF、bFGF的表達(dá)情況進(jìn)行分析，希望可以為臨床治療、預(yù)防宮頸癌的發(fā)生提供一定的參考價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至12月本院收治的宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者作為研究對(duì)象，同時(shí)選擇正常宮頸組織作為對(duì)照對(duì)象，均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。宮頸癌患者60例，年齡范圍為28～56歲，年齡（50.4±2.3）歲；其中腺癌22例、鱗癌38例；分期：Ⅳ期4例、Ⅲ期10例、Ⅱ期21例、Ⅰ期25例；分化程度：低分化14例、中分化20例、高分化26例。所有患者在術(shù)前沒有接受放化療，人宮頸癌細(xì)胞系Hela由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室提供。宮頸上皮內(nèi)瘤變患者20例，年齡范圍為24～58歲，年齡（50.6±2.7）歲；其中子宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅲ級(jí)6例、CINⅡ級(jí)8例、CINⅠ級(jí)6例。正常宮頸組織20例，年齡范圍為28～55歲，年齡（50.1±2.1）歲，均取自子宮腺肌病或者是子宮肌瘤手術(shù)切除子宮標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌組織中aFGF、bFGF檢測 通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法對(duì)宮頸癌組織中aFGF、bFGF總RNA進(jìn)行提取，使用抽提試劑盒（Trizol）。紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA純度、濃度進(jìn)行檢測，使用β激動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 在設(shè)定好的條件下反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μl，引物1μl，RNA 2μl。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增：TaqDNA聚合酶（0.2μl）、取正反向引物（1μl）、cDNA（3μl），加入到反應(yīng)體系中。參數(shù)：94℃下反應(yīng)40 s、94℃下變性3 min、56℃下反應(yīng)1 min、72℃下反應(yīng)1 min，一共30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下反應(yīng)5 min。PCR產(chǎn)物：經(jīng)凝膠成像、分析掃描求相對(duì)值。

1.2.3 對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響檢測 四甲基偶氮鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法：（1）常規(guī)培養(yǎng)。（2）試驗(yàn)分組：將增殖期細(xì)胞接種（96孔板），在5%CO2、37℃下恒溫培養(yǎng)，aFGF組、bFGF組都是對(duì)細(xì)胞作用進(jìn)行觀察，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組。（3）增加因素：細(xì)胞亞融合吸出舊培養(yǎng)液，在每孔中加入無血清培養(yǎng)液，劑量為200μl，后重復(fù)吸出操作。根據(jù)分組加入不同劑量的培養(yǎng)液、aFGF、bFGF、8μl肝素，讓每個(gè)孔的終體積始保持200μl。見表2。（4）MTT比色：將孔板放到回孵箱，加入MTT溶液。繼續(xù)孵育，加入二甲基亞砜（DMSO），對(duì)每孔OD值讀?。嘎?lián)免疫儀），波長620 nm，參考波長490 nm。計(jì)算抑制率、細(xì)胞增殖。

采用MTT法對(duì)照組的aFGF值為0/0/0/0μg/ml，bFGF值為0/0/0/0μg/ml；aFGF組的aFGF值為0.15/0.30/0.60/1.20μg/ml，bFGF值為0/0/0/0μg/L；bFGF組為0/0/0/0μg/L，bFGF值為25.00/50.00/75.00/100.00μg/L。

1.3 觀察指標(biāo) 分析各組人群aFGF mRNA與bFGF mRNA基因的表達(dá)半定量結(jié)果，分析aFGF、bFGF對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組內(nèi)對(duì)比，進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組人群aFGFmRNA與bFGFmRNA的基因表達(dá)半定量結(jié)果分析 aFGFmRNA與bFGFmRNA基因表達(dá)在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中高于對(duì)照組（均P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ期aFGFmRNA與bFGFmRNA基因表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期（均P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ期aFGF mRNA與bFGF mRNA基因表達(dá)高于宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者（均P＜0.05），在高、中、低分化宮頸癌中aFGFmRNA與bFGF mRNA基因表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故與腫瘤病理類型沒有明顯的關(guān)系。分期一樣，aFGF mRNA的表達(dá)和bFGF mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 各組人群aFGFmRNA與bFGFmRNA的基因表達(dá)半定量結(jié)果分析（）

表2 各組人群aFGFmRNA與bFGFmRNA的基因表達(dá)半定量結(jié)果分析（）

注：以上各值以β激動(dòng)蛋白為參照的相對(duì)值；aFGF為酸性成纖維細(xì)胞生長因子，bFGF堿性成纖維細(xì)胞生長因子，對(duì)照組為正常宮頸組織者；與對(duì)照組相比，a P＜0.05；與Ⅰ期、Ⅱ期相比，b P＜0.05

組別對(duì)照組宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組宮頸癌組Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期高分化中分化低分化例數(shù)20 20 60 25 21 10 4 26 20 14 aFGFmRNA 0.645±0.036 0.759±0.092a 1.227±0.048a 0.967±0.048a 1.032±0.077a 1.300±0.128ab 1.342±0.141ab 1.189±0.110a 1.139±0.127a 1.192±0.096a bFGFmRNA 0.656±0.114 0.799±0.063a 1.324±0.095a 0.999±0.101a 1.179±0.044a 1.367±0.125ab 1.399±0.130ab 1.238±0.095a 1.295±0.105a 1.319±0.097a

2.2 aFGF、bFGF對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響分析 aFGF mRNA的表達(dá)和bFGF mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）；bFGF mRNA略高于aFGF mRNA，但是整體沒有太大差異（P＞0.05）；aFGF、bFGF水平增高，兩組增殖都明顯，但是bFGF組增殖更明顯，75.00μg/ml濃度時(shí)程度最高，見表3。

表3 aFGF、bFGF對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響分析（80例）

3 討 論

宮頸病變是一個(gè)較長的過程，不斷惡化與腫瘤分裂、增殖有密切的關(guān)系，還與血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活、不斷增殖、遷移有很大的關(guān)系［3］。

aFGF、bFGF是FGF家族中非常重要的兩位成員，尤其是bFGF。aFGF主要是促進(jìn)皮膚組織成長修復(fù)，bFGF主要是促進(jìn)多種細(xì)胞增殖。bFGF活躍度越高血管生成速度就越快，從而會(huì)導(dǎo)致腫瘤血管形成，腫瘤血管形成后會(huì)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供機(jī)會(huì)，為細(xì)胞生長提供養(yǎng)分［4］。aFGF、bFGF之間有相似性，生物學(xué)功能、作用受體是相同的。在很多生物活性的分析當(dāng)中，bFGF比aFGF更強(qiáng)。aFGF、bFGF在很多組織當(dāng)中都有分布，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、繁殖期間具有重要作用。

很多學(xué)者在食管鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺癌等組織中均可以檢測到aFGF、bFGF與其受體表達(dá)。此次研究結(jié)果顯示，aFGF mRNA與bFGFmRNA基因在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中存在過度表達(dá)現(xiàn)象，aFGF mRNA與bFGF mRNA基因表達(dá)在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中均高于對(duì)照組（均P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ期aFGFmRNA與bFGFmRNA基因表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期（均P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ期aFGF mRNA與bFGF mRNA基因表達(dá)高于宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（均P＜0.05），在高、中、低分化宮頸癌中aFGF mRNA與bFGF mRNA基因表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故與腫瘤病理類型沒有明顯的關(guān)系。分期一樣，aFGFmRNA的表達(dá)和bFGFmRNA的表達(dá)存在關(guān)系（P＜0.05），這就說明，在宮頸癌細(xì)胞異常分裂、增殖中，aFGF、bFGF可能以自分泌形式刺激細(xì)胞進(jìn)行增殖、分裂。

綜上所述，aFGF、bFGF因子在宮頸癌發(fā)生、增殖、浸入期間發(fā)揮著重要的作用，可以將其作為重要指標(biāo)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。