馬迎輝 胡勝 胡驍 吳勇 金杰

鄂東醫(yī)院集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 435000

膠質(zhì)瘤是成年人最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)切除、放療和化療是膠質(zhì)瘤主要的治療方法，但其整體預(yù)后較差［1］。膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移是影響其療效和預(yù)后的主要因素，探究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有助于尋找新的治療靶點(diǎn)和提供膠質(zhì)瘤的診治水平［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一類(lèi)非編碼RNA，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。越來(lái)越多的研究證實(shí)，lncRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程，與腫瘤患者的生存期密切相關(guān)［4］。lncRNA已成為近年來(lái)膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。PWRN2屬于lncRNA家族成員，其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及生物學(xué)功能并不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中PWRN2的表達(dá)，觀察PWRN2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程的調(diào)控作用，探究PWRN2可能的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的分子診斷和基因靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本、細(xì)胞系和主要試劑 選取2018年1月至2019年12月本院神經(jīng)外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤的腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織，組織標(biāo)本于液氮中保存。所有膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未行化療或放療。HEB、U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；陰性對(duì)照病毒（LV-NC）、PWRN2重組慢病毒（LV-PWRN2）、PCR引物購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜和噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購(gòu)自上海生工生物科技有 限 公 司；一 抗Klotho、TGF-β1/2、TGF-β、SALL4、p-Smad2、β-actin購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染 HEB、U-87 MG、C6、U251細(xì)胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，LN382、SNB-19細(xì)胞株采用含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。U-87 MG細(xì)胞接種于6孔板，接種量以過(guò)夜培養(yǎng)后匯合度達(dá)60%為準(zhǔn)。感染復(fù)數(shù)設(shè)定為30，以LV-NC感染U-87 MG細(xì)胞作為對(duì)照組（4個(gè)細(xì)胞），以攜帶PWRN2序列的LV-PWRN2感染的U-87 MG細(xì)胞作為試驗(yàn)組（4個(gè)細(xì)胞），根據(jù)慢病毒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行感染操作。12 h后更換為含10%FBS、100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3 qPCR檢測(cè) 運(yùn)用Trizol法分別提取組織和細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度檢測(cè)純度和濃度，以500 ng總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qPCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)PWRN2和Klotho mRNA的表達(dá)水平。qPCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。qPCR引物序列：Klotho正向引物5’-GTGCGTCCATCTGGGATACG-3’，反向引物5’-TGTCGCGGAAGACGTTGTT-3’；GAPDH正向引物5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反 向 引 物5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；PWRN2正 向 引 物5’-TGAGAGGAGATTTCAGGACGTT-3’，反 向 引 物5’-CAGTTTGCTTCAAGGTTACATCC-3’。

1.4 四甲基偶氮鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測(cè)U-87 MG細(xì)胞增殖能力 收集兩組U-87 MG細(xì)胞，采用DMEM/F12培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液。分別以1 000個(gè)/孔接種于96孔板。分別于接種后第1、2、3、4、5天進(jìn)行MTT檢測(cè)，以10μl/孔加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入120μl二甲基亞砜，保證結(jié)晶溶解，20 min內(nèi)采用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度（A）值，繪制U-87 MG細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U-87 MG細(xì)胞遷移能力 收集兩組U-87 MG細(xì)胞，采用DMEM/F12培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液并接種于6孔板。采用200μl在6孔板底部進(jìn)行劃痕，采用含100 U/ml青-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基洗3次。此時(shí)記為0 h，在100×顯微鏡下拍照，Image Pro Plus軟件測(cè)量劃痕距離A1。連續(xù)培養(yǎng)24 h，在100×顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕距離A2。計(jì)算細(xì)胞遷移率=（A1-A2）/A1×100%，代表U-87 MG細(xì)胞遷移能力。

1.6 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集兩組U-87MG細(xì)胞，采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定總蛋白濃度后，每孔上樣40μg蛋白，以SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉液中進(jìn)行封閉。采用封閉液按1∶1 000稀釋所有一抗，在4℃下進(jìn)行孵育過(guò)夜。采用封閉液按1∶10 000稀釋所有二抗，在室溫下進(jìn)行孵育，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光、顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PWRN2在膠質(zhì)瘤及癌旁組織組織中的表達(dá)qPCR檢測(cè)顯示，膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中PWRN2表達(dá)量分別為（1.25±0.52）和（6.28±0.66），PWRN2在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)（P＜0.01）。

2.2 PWRN2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) qPCR檢測(cè)顯示，5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U-87 MG、LN382、C6、SNB-19、U251）和正常腦膠質(zhì)細(xì)胞株HEB中PWRN2的表達(dá)量分別為（0.13±0.02）、（0.55±0.06）、（0.73±0.07）、（0.34±0.04）、（0.47±0.03）和（1.00±0.04）。與HEB相比，PWRN2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中低表達(dá)（P＜0.05），在U-87 MG細(xì)胞株中表達(dá)最低（P＜0.01），故選擇U-87 MG細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 兩組細(xì)胞中PWRN2的表達(dá) qPCR檢測(cè)顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組U-87 MG細(xì)胞中PWRN2的表達(dá)分別為（10.28±0.84）和（1.02±0.12），試 驗(yàn) 組U-87 MG細(xì) 胞 中PWRN2的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）。

2.4 過(guò)表達(dá)PWRN2對(duì)U-87 MG細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測(cè)兩組U-87 MG細(xì)胞的增殖能力，在第2天開(kāi)始，試驗(yàn)組U-87 MG細(xì)胞的吸光度較對(duì)照組明顯降低，見(jiàn)圖1，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)PWRN2可抑制U-87 MG細(xì)胞的增殖能力。

圖1 四甲基偶氮鹽微量酶反應(yīng)比色法檢測(cè)兩組U-87 MG細(xì)胞的增殖能力

2.6 過(guò)表達(dá)PWRN2對(duì)U-87 MG細(xì)胞遷移能力的影響 試驗(yàn)組和對(duì)照組U-87 MG細(xì)胞遷移率分別為（68.41±7.62）%和（27.96±4.87）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明過(guò)表達(dá)PWRN2可降低U-87 MG細(xì)胞的遷移能力。

2.7 兩組細(xì)胞中Klotho mRNA的表達(dá) qPCR定量檢測(cè)顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組U-87 MG細(xì)胞中Klotho mRNA的表達(dá)量分別為（4.33±0.53）和（1.01±0.09），試驗(yàn)組U-87 MG細(xì)胞中Klotho mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)PWRN2能夠促進(jìn)Klotho mRNA的表達(dá)。

2.8 兩組細(xì)胞中Klotho及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組U-87 MG細(xì)胞中Klotho蛋白表達(dá)增加，TGF-β信號(hào)通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)降低，見(jiàn)圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)PWRN2可導(dǎo)致Klotho蛋白表達(dá)增加，TGF-β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。

圖2 蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)兩組U-87 MG細(xì)胞Klotho及TGF-β信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

3 討 論

膠質(zhì)瘤長(zhǎng)期占據(jù)顱內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率的首位，其高轉(zhuǎn)移性和高復(fù)發(fā)性導(dǎo)致患者的預(yù)后較差［5］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因靶向治療已成為膠質(zhì)瘤重要的輔助治療方式。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控特定基因的表達(dá)，在各種細(xì)胞分子通路中發(fā)揮重要作用，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展［6］。越來(lái)越多的研究表明，多個(gè)lncRNA如FOXD2-AS1［7］、GATA6-AS［8］、FoxD2-AS1［9］等的 異 常 表達(dá)參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、耐藥、放療敏感性、遷移等惡性生物學(xué)行為，且與膠質(zhì)瘤患者的療效、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)。PWRN2在膠質(zhì)瘤中的臨床意義和生物學(xué)功能未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)檢測(cè)臨床組織標(biāo)本和細(xì)胞株中PWRN2的表達(dá)，證實(shí)PWRN2高表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株，表明PWRN2可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探究PWRN2的生物學(xué)功能，本研究選擇表達(dá)量最低的U-87 MG細(xì)胞，通過(guò)LV-PWRN2促進(jìn)細(xì)胞中PWRN2的表達(dá)。本研究通過(guò)MTT法和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)PWRN2表達(dá)均可明顯抑制膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞的增殖和遷移。Klotho基因位于染色體13q12，最初被認(rèn)為是一種抗衰老基因［10］。Klotho蛋白屬于膜結(jié)合蛋白，在人體多個(gè)正常組織中均可表達(dá)，具有調(diào)控鈣磷代謝、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等作用［11］。近年研究顯示，Klotho蛋白在胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，Klotho表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與腫瘤患者的生存期相關(guān)，證明Klotho基因是一種抑癌基因［12］。研究表明，膠質(zhì)瘤組織中Klotho基因啟動(dòng)子的甲基化程度明顯增加，Klotho蛋白的表達(dá)明顯降低，Klotho表達(dá)水平越高，膠質(zhì)瘤患者的生存在越長(zhǎng)，Klotho可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展［13］。本研究顯示，特異性增加U-87 MG細(xì)胞中PWRN2的表達(dá)，Klotho基因的表達(dá)明顯上調(diào)，PWRN2可促進(jìn)Klotho基因的表達(dá)。TGF-β信號(hào)通路是介導(dǎo)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要通路之一［14］。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Klotho基因表達(dá)上調(diào)后，TGF-β信號(hào)通路蛋白如TGF-β、SALL4、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)明顯降低，表明TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。PWRN2調(diào)控Klotho基因表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不清楚，是下一步研究的方向。

綜上所述，PWRN2在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，上調(diào)PWRN2可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG的增殖和遷移能力，其分子機(jī)制可能是PWRN2通過(guò)促進(jìn)Klotho的表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PWRN2可能在膠質(zhì)瘤的分子診斷和基因靶向治療研究中具有重要價(jià)值。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。