楊 帆，沈俊逸，蔡 輝

0 引言

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以自身抗體病理性增多和非特異性系統(tǒng)器官損傷為特征的慢性免疫性疾病[1]，此外，其與基因、環(huán)境、內(nèi)分泌紊亂、表觀遺傳等因素也密切相關(guān)[2]。雖然病因復(fù)雜，但是眾多研究證實(shí)，免疫耐受缺失及免疫穩(wěn)態(tài)失衡是SLE最重要的發(fā)病基礎(chǔ)，包括T細(xì)胞增殖和分化功能缺陷、病理性T細(xì)胞大量聚集、T細(xì)胞自身凋亡增加等[3]，因此，深入探索SLE患者T細(xì)胞異?；罨姆肿用庖邫C(jī)制，對(duì)于臨床療效的判斷和靶向生物制劑的開(kāi)發(fā)都具有重要的研究?jī)r(jià)值。中藥復(fù)方或單體成分在免疫性疾病領(lǐng)域的作用越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注[4]。人參皂苷因具有甾環(huán)樣結(jié)構(gòu)、類(lèi)糖皮質(zhì)激素樣作用、免疫調(diào)節(jié)功能等，是眾多治療SLE中藥組方中的重要成分之一[5]。人參皂苷Rb1是臨床上常用的免疫佐劑[6-7]，但是否能用于SLE的治療尚不明確。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討人參皂苷Rb1對(duì)SLE患者外周血T淋巴細(xì)胞體外活化、增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象選擇 選擇2019年1-12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院首次確診的SLE門(mén)診或住院患者30例，所有患者均為女性，年齡27～65歲，平均年齡(48.10±10.90)歲；病程3～53個(gè)月，中位病程21.0個(gè)月。本研究血液標(biāo)本的采集符合倫理學(xué)要求，并獲得受試者的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1997年推薦的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(Systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)<10分者[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病或嚴(yán)重感染性疾病者。另外，收集同時(shí)期30例健康女性志愿者捐獻(xiàn)的外周血樣本，年齡25～60歲，平均年齡(45.63±12.12)歲。SLE患者和健康志愿者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 人參皂苷Rb1(純度>98% HPLC，規(guī)格：20 mg，天津馬克生物有限公司)，用DMSO制備成1 mg/ml儲(chǔ)備液，分裝凍存于-20 ℃，用前6 h稀釋至所需濃度(DMSP最終濃度<1%)。人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque Solution)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清，美國(guó)Hyclone公司。刀豆球蛋白A(ConcanavalinA，ConA)，美國(guó)Sigma公司；3H標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，比活性：2～10 mCi/mg，美國(guó)Molecular Probes公司)，將1 mCi/ml溶液以生理鹽水稀釋成100 μCi/ml，于4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD4-PerCP-Cyanine5.5、鼠抗人CD8-PE、鼠抗人FITC-CD69、鼠抗人CD25-FITC、鼠抗人PE-Foxp3，美國(guó)BD公司；白細(xì)胞介素4(Interleukin4，IL-4)ELISA試劑盒和干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)ELISA試劑盒，武漢艾美捷科技有限公司。DPM-7001型液體閃爍計(jì)數(shù)器，法國(guó)SDEC公司；流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)，美國(guó)Becton-Dickinson公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血T淋巴細(xì)胞的分離 采集入組受試者外周靜脈血15 ml，置于肝素抗凝管中，加入等體積PBS稀釋?zhuān)捎肍ICOLL密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。2 000 r/min離心30 min，用毛細(xì)血管輕輕吸取中間層白色絮狀物(PBMCs比重約為1.075～1.090)，置于另一離心管中，用PBS洗滌2次，磁珠分選緩沖液重懸，得到PBMCs(>95%)。

1.3.2 CD3+T淋巴細(xì)胞的分選 取上述PBMCs懸液，采用免疫磁珠法分選CD3+T淋巴細(xì)胞。用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液(2 mmol/L谷氨酰胺+10 mg/L非必需氨基酸+1 mmol/L丙酮酸鹽+100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素+5 μg/ml植物血凝素)重懸，得到CD3+T淋巴細(xì)胞懸液(>95%)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)體細(xì)胞來(lái)源分為2組：健康對(duì)照(control)組和SLE組，每組進(jìn)一步分為空白組、ConA組，ConA+Rb1組。空白組：將T淋巴細(xì)胞按1×105/孔接種至96孔板中后，未經(jīng)任何藥物處理；ConA組：將T淋巴細(xì)胞按1×105/孔接種至96孔板中后，加入10 μg/ml ConA刺激72 h；ConA+Rb1組：將T淋巴細(xì)胞按1×105/孔接種至96孔板中后，加入10 μg/ml ConA刺激72 h，同時(shí)加入Rb1干預(yù)。

1.3.43H-TdR滲入法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖活性 取上述純化的T淋巴細(xì)胞，設(shè)為空白組、ConA組，ConA+各濃度人參皂苷Rb1(2.5、5、10、20 μmol/L)組。加入不同藥物干預(yù)72 h后，每孔加入0.5 μCi3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞至玻璃纖維濾紙上，烘干后用液體閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞增殖率(%)=(ConA組-空白組)/空白組×100%；細(xì)胞增殖抑制率(%)=(ConA組-ConA+Rb1組)/ConA組×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞早期活化抗原CD69表達(dá)水平 T淋巴細(xì)胞分組和處理方式同“1.3.3”，人參皂苷Rb1作用濃度為10 μmol/L，收集細(xì)胞約1×107個(gè)。PBS離心(1 000 r/min，4 ℃，5 min)洗滌，加入CD4-PerCP-Cyanine5.5、CD8-PE、FITC-CD69，混勻后室溫避光染色30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分化水平 T淋巴細(xì)胞分組和處理方式同“1.3.3”，人參皂苷Rb1作用濃度為10 μmol/L，收集細(xì)胞約1×107個(gè)，處理方式同“1.3.5”。加入CD4-PerCP-Cyanine 5.5、CD25-FITC，4 ℃孵育30 min，4%甲醛固定20 min，破膜處理，加入PE-Foxp3，混勻后室溫避光染色30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ水平 取上述純化的T淋巴細(xì)胞，設(shè)為空白對(duì)照組(未加藥物處理)、各濃度人參皂苷Rb1(2.5、5、10、20 μmol/L)組，培養(yǎng)48 h。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1 人外周血CD3+T淋巴細(xì)胞分選鑒定 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，磁珠分選得到的CD3+T淋巴細(xì)胞懸液中CD3+T淋巴細(xì)胞比例為98.95%，細(xì)胞形態(tài)均一，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞>95%。見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)免疫磁珠分選后，CD3+T淋巴細(xì)胞含量

2.23H-TdR滲入法檢測(cè)人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 SLE人群空白組外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性明顯高于健康對(duì)照人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ConA可明顯刺激SLE人群和健康對(duì)照人群外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活性(增殖率：410.71%±128.59%vs.321.30%±96.54%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，加入Rb1后，對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，而且當(dāng)Rb1濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，抑制作用最為明顯，當(dāng)Rb1濃度為10 μmol/L時(shí)，抑制率分別為40.87%±9.82%和53.94%±9.12%，Rb1對(duì)SLE人群外周血T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用高于健康對(duì)照人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞CD69+表達(dá)的影響 采用雙抗體染色法，ConA可明顯刺激SLE人群和健康對(duì)照人群外周血T淋巴細(xì)胞早期活化(CD3+CD69+T/CD3+T細(xì)胞比例：48.53%±7.26%vs.53.73%±8.45%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，加入10 μmol/L Rb1對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞早期活化有顯著的抑制作用，CD3+CD69+T/CD3+T細(xì)胞比例分別為31.28%±5.32%vs.33.64%±5.79%，Rb1對(duì)SLE人群和健康對(duì)照人群外周血T淋巴細(xì)胞早期活化的抑制比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞早期活化標(biāo)志物CD69+表達(dá)的影響

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞分化的影響 經(jīng)10 μmol/L Rb1后，健康對(duì)照組和SLE組外周血T淋巴細(xì)胞CD4+CD25+T細(xì)胞百分比(24.38%±5.45%、16.29%±3.18%)和CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞百分比(32.76%±7.43%、26.35%±5.14%)顯著增加，與ConA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞分化的影響

2.5 人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 經(jīng)10 μmol/L Rb1后，健康對(duì)照組和SLE組外周血T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平顯著增加，而IL-4水平顯著降低，與ConA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 人參皂苷Rb1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

3 討論

SLE目前臨床治療以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等作為一線基礎(chǔ)用藥，常用的免疫抑制劑包括糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤等傳統(tǒng)免疫抑制劑或單克隆抗體、環(huán)孢素A、他克莫司等新型免疫抑制劑以抑制T細(xì)胞增殖和抗體生成，但是均存在選擇性差、毒副作用嚴(yán)重等不足[10]，而且單一靶點(diǎn)的治療藥物難以取得全面持久的作用效果。而中醫(yī)在SLE治療中具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)，大大改善了眾多SLE患者預(yù)后。

2013年，趙偉剛等[11]研究表明，人參皂苷膠囊聯(lián)合潑尼松治療SLE療效顯著，SLE疾病活動(dòng)指數(shù)降低值優(yōu)于單獨(dú)使用潑尼松組。人參是我國(guó)傳統(tǒng)的扶正固本、益氣生津的名貴中藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制分析，其皂苷類(lèi)活性成分具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。呂夢(mèng)婕等[12]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可抑制小鼠T淋巴細(xì)胞的體外活化及增殖活性，是一種潛在的免疫抑制劑，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平有關(guān)。T淋巴細(xì)胞既是體液免疫的核心分子，又是機(jī)體自身免疫的上游靶點(diǎn)，其活化-凋亡失衡是介導(dǎo)SLE發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。因此，針對(duì)T淋巴細(xì)胞異常研發(fā)相關(guān)的藥物，有望為SLE患者帶來(lái)治愈希望。

在本研究中，雖然納入的SLE人群均處于疾病非活動(dòng)期，并服用不同劑量免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療，T淋巴細(xì)胞的活性受到了一定程度的抑制，但是其外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性仍然高于健康對(duì)照人群。ConA是基礎(chǔ)研究中最常使用的一類(lèi)植物凝集素，通過(guò)作用于T淋巴細(xì)胞表面TCR/CD3復(fù)合體進(jìn)而刺激T淋巴細(xì)胞增殖，而人參皂苷Rb1不僅可抑制ConA刺激的健康對(duì)照人群外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性，同樣也可抑制SLE人群外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活性，而且當(dāng)Rb1濃度為10 μmol/L時(shí)，抑制作用已經(jīng)十分明顯。CD69是T淋巴細(xì)胞早期活化標(biāo)志物，人參皂苷Rb1可抑制健康對(duì)照人群和SLE人群CD69表達(dá)，說(shuō)明其可以抑制T淋巴細(xì)胞體外活化，干擾T淋巴細(xì)胞由靜息期向淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制其增殖作用以及相關(guān)免疫功能。此外，人參皂苷Rb1對(duì)SLE人群外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性的抑制作用略高于健康對(duì)照人群，推測(cè)可能的原因與SLE患者外周血T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，包括T細(xì)胞膜信號(hào)中的免疫突觸異常、細(xì)胞內(nèi)鈣能增強(qiáng)等因素有關(guān)。

此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在SLE發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。臨床研究證實(shí)，SLE患者普遍存在CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量減少及功能下降[14-15]。CD4+CD25+T細(xì)胞缺失易導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)自身抗原過(guò)度免疫應(yīng)答，進(jìn)而對(duì)自身組織造成損傷；此外，還可以促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子INF-γ、TNF-α等大量分泌，進(jìn)一步加重機(jī)體組織損傷。而FoxP3是CD4+CD25+T細(xì)胞活化的重要標(biāo)志分子之一。在本研究中，人參皂苷Rb1可顯著促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量和CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞數(shù)量，這可能也是人參皂苷Rb1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，治療SLE的重要機(jī)制之一。由于SLE屬于異質(zhì)性疾病，不同患者存在不同的免疫狀態(tài)，Talaat等[16]認(rèn)為，SLE病情活動(dòng)初期多呈現(xiàn)Th1型活化優(yōu)勢(shì)，INF-γ等細(xì)胞因子水平顯著增加，從而增加自身抗原遞呈；但隨著疾病進(jìn)展，SLE患者逐漸偏向Th2型優(yōu)勢(shì)，IL-4等細(xì)胞因子分泌量逐漸增加。而Dolff等[17]發(fā)現(xiàn)，在SLE患者體內(nèi)，細(xì)胞因子的平衡偏向Th1型，尤其在Ⅳ型狼瘡腎炎患者中呈現(xiàn)明顯Th1優(yōu)勢(shì)。Th1/Th2免疫失衡是導(dǎo)致SLE發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。在本研究中，納入的SLE患者已出現(xiàn)典型的臨床癥狀，因此,以Th2型優(yōu)勢(shì)為主，但是仍表現(xiàn)為T(mén)h1/Th2失衡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可促進(jìn)INF-γ產(chǎn)生，抑制IL-4的分泌，故而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡可能也是人參皂苷Rb1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了人參皂苷Rb1可抑制ConA刺激的SLE患者外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性，同時(shí)增加CD4+CD25+T細(xì)胞比例，維持Th1/Th2免疫平衡，為其用于自身免疫性疾病的治療提供了有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。