郭焱

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鹽城 224000

腦安顆粒具有活血化瘀、益氣通絡(luò)的功效，主要用于腦血栓形成急性期、恢復(fù)期氣虛血瘀證候者的治療，該中藥復(fù)方制劑由川芎、當(dāng)歸、紅花、人參、冰片5味中藥加工而成，收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正》第34冊[1]。方中君藥川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有抑制血小板聚集、改善冠狀動脈血流量、抗缺血再灌注損傷、降低血管阻力等作用，與臣藥當(dāng)歸同屬一科，兩者均以苯酞類為主的揮發(fā)油類成分為主要活性成分，具有相似的化學(xué)成分，還含有有機(jī)酸類、生物堿類等成分[2-4]。紅花為佐藥，其藥效成分羥基紅花黃色素A能有效改善患者神經(jīng)功能缺損程度，促進(jìn)急性腦梗死患者的康復(fù)[5-6]。《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正》第34冊采用薄層熒光掃描法對腦安顆粒中人參皂苷Re做定量測定，此方法操作煩瑣、誤差較大，且難以全面評價藥品質(zhì)量。參考文獻(xiàn)[7]采用超高效液相色譜法(UPLC)測定腦安顆粒中的多種人參皂苷成分，但尚未有采用UPLC同時定量測定腦安顆粒中其他多種成分的文獻(xiàn)報道。為了全面評價腦安顆粒的質(zhì)量，完善其質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用UPLC波長切換法對其中洋川芎內(nèi)酯 A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A 9種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，為進(jìn)一步的臨床研究提供參考。

1 材料

Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、2998型二極管陣列檢測器、Empower 2.0工作站；AUW-220D型電子天平(d=0.01 mg，美國島津公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司，功率：500 W，頻率：50 kHz)。

對照品阿魏酸(批號：110773-201915，純度：99.4%)、綠原酸(批號：110753-201817，純度：96.8%)、鹽酸川芎嗪(批號：110817-201608，純度：83.4%)、藁本內(nèi)酯(批號：111737-201910，純度：100.0%)、羥基紅花黃色素A(批號：111637-201810，純度：93.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內(nèi)酯 A(批號：CHB170817)、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ(批號：CHB161125)、洋川芎內(nèi)酯 H(批號：CHB171229)、阿魏酸松柏酯(批號：CHB170912)、川芎嗪(批號：CHB180627)均購于上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度均≥98.0%；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

腦安顆粒購自藥店，共收集到3個廠家13個批次的樣品，規(guī)格：1.2 g/袋，產(chǎn)品信息見表1。

表1 13批腦安顆粒樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，5%～10%A；12～15 min，10%～38%A；15～22 min，38%～55%A；22～25 min，55%～5%A；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：0～8 min，285 nm(綠原酸、川芎嗪)；8～10 min，320 nm(阿魏酸)；10～12 min，304 nm(羥基紅花黃色素A)；12～19 min，285 nm(洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A)；19～25 min，320 nm(藁本內(nèi)酯)[8-11]；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯對照品各適量，加55%甲醇超聲處理溶解后制成質(zhì)量濃度分別為0.206 7、0.200 2、0.193 7、0.081 6、0.138 9、0.126 3、0.145 1、0.124 7、0.342 4 mg·mL-1的混合對照品儲備液，置冰箱冷藏避光保存，備用。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異項下的腦安顆粒，研勻，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加入55%甲醇約30 mL，30 ℃超聲處理(功率：500 W，頻率：50 kHz)45 min，放冷至室溫，再用55%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，冷藏避光保存。

2.2.3陰性供試品溶液的制備 按照腦安顆粒處方工藝分別制備缺川芎、當(dāng)歸、紅花的陰性樣品，依照2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，即得陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液、陰性供試品溶液、空白溶劑各2 μL，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果理論板數(shù)均大于9800，9種成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，拖尾因子均小于1.15，空白溶劑與陰性供試品溶液中的其他成分對9種成分的測定無干擾，說明該色譜系統(tǒng)專屬性較好。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.樣品；C.缺川芎、當(dāng)歸陰性樣品；D.缺紅花陰性樣品；1.綠原酸；2.川芎嗪；3.阿魏酸；4.羥基紅花黃色素A；5.洋川芎內(nèi)酯Ⅰ；6.洋川芎內(nèi)酯H；7.阿魏酸松柏酯；8.洋川芎內(nèi)酯A；9.藁苯內(nèi)酯。圖1 對照品、陰性樣品及腦安顆粒溶液UPLC圖

2.3.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置20 mL量瓶中，加55%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液和混合對照品儲備液，設(shè)置進(jìn)樣體積為2 μL，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，繪制各組分回歸曲線，計算相應(yīng)回歸方程

和相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明，洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比S/N=10時的質(zhì)量濃度為各成分的定量限(LOQ)，結(jié)果見表2。

表2 腦安顆粒9種有效成分的線性范圍

2.3.3精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并計算9種成分峰面積的RSD。結(jié)果洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯峰面積RSD(n=6)分別為1.03%、0.86%、0.72%、0.65%、0.88%、0.91%、0.58%、1.11%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(S4)，分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并計算9種成分峰面積的RSD。結(jié)果洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD(n=7)分別為1.08%、1.02%、0.79%、0.88%、0.91%、0.67%、0.83%、0.81%、0.98%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(S4)6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積，按2.3.2項下回歸方程計算9種成分的含量及其RSD。結(jié)果洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.297 8、0.261 3、0.258 8、0.110 9、0.361 7、0.302 1、0.215 4、0.197 2、1.115 3 mg·g-1，RSD(n=6)分別為1.07%、1.13%、0.98%、0.89%、1.01%、0.75%、0.85%、0.69%、0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品(S4)6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯混合對照品溶液(質(zhì)量濃度分別為101.3、89.2、87.3、37.53、123.2、103.4、74.13、67.27、117.07 μg·mL-1)1.50 mL，按2.2.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算各成分加樣回收率及相應(yīng)RSD。結(jié)果洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯平均加樣回收率及RSD分別為100.01%(RSD為0.75%)、99.57%(RSD為0.62%)、99.21%(RSD為0.53%)、99.35%(RSD為1.10%)、99.94%(RSD為0.65%)、99.84%(RSD為1.11%)、98.70%(RSD為0.56%)、99.59%(RSD為0.78%)、99.26%(RSD為1.03%)，結(jié)果見表3。

表3 腦安顆粒9種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3

2.4 樣品含量測定

取供試品13批，分別按照2.2.2項下條件制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件平行進(jìn)樣3針，記錄色譜圖及峰面積，按2.3.2項下回歸方程計算9種活性成分含量，結(jié)果見表4。

表4 腦安顆粒中9種成分含量測定結(jié)果 mg·g-1

2.5 化學(xué)模式識別分析

將13批腦安顆粒含量測定結(jié)果輸入SPSS 22.0軟件和SIMCA 14.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2.5.1聚類分析 系統(tǒng)聚類分析是根據(jù)測定樣品的數(shù)據(jù)，將研究對象劃分為不同類別，類別內(nèi)的研究對象有相似特點(diǎn)，類別間的對象則有所不同的一種多元統(tǒng)計分析方法[12-13]。利用 SPSS 22.0軟件，采用利差平方和法(Ward 法)，以歐式距離平方為樣品測度，對13批樣品進(jìn)行聚類分析。分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歐式距離為5時，13批樣品被分成了3類：S1、S2、S3、S4、S5為第I類，S6、S7、S8、S9、S10為第Ⅱ類，S11、S12、S13為第Ⅲ類。第I類均為河南省百泉制藥有限公司產(chǎn)品，第Ⅱ類全部為上海祥鶴藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，第Ⅲ類全部為遼源譽(yù)隆亞東藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。說明同一廠家產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性，不同廠家的樣品之間存在一定差異。聚類分析樹狀圖見圖2。

圖2 13批腦安顆粒聚類分析樹狀圖

2.5.2主成分分析及藥物質(zhì)量評價 以13批腦安顆粒中的9個成分含量為指標(biāo)建立數(shù)據(jù)集，輸入SPSS 22.0軟件，運(yùn)用因子分析中的主成分分析處理，提取累積方差貢獻(xiàn)率>85%的因子[14-18](A1、A2、A3)作為主成分，其中A1特征值為5.718，方差貢獻(xiàn)率為62.421%，A2特征值為1.469，方差貢獻(xiàn)率為16.327%，A3特征值為1.227，方差貢獻(xiàn)率為13.633%。3個主成分的相關(guān)系數(shù)矩陣及因子得分矩陣見表4～5。由表4可知，川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯和藁本內(nèi)酯之間均具有較大的正相關(guān)性。由表5因子得分矩陣可知，洋川芎內(nèi)酯 Ⅰ、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯對主成分A1貢獻(xiàn)較大，洋川芎內(nèi)酯 A和洋川芎內(nèi)酯 H對主成分A2貢獻(xiàn)較大，川芎嗪和羥基紅花黃色素A對主成分A3貢獻(xiàn)較大。

以每個主成分的特征值占累加特征值的百分比作為權(quán)重系數(shù)進(jìn)行線性組合，可得到綜合得分計算公式(1)。

F=0.624F1+0.163F2+0.136F3

(1)

F代表綜合得分，F(xiàn)1、F2和F3分別代表3個主成得分，其中Fn=FACn×相應(yīng)特征值的算術(shù)平方根(n代表1、2、3，F(xiàn)AC為主成分的因子得分系數(shù))，結(jié)果見表6。綜合得分越高，說明以9個有效成分為指標(biāo)的腦安顆粒質(zhì)量越好。由表7可知，上海祥鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量較好。

表5 腦安顆粒中9種成分相關(guān)系數(shù)矩陣

表6 腦安顆粒中9種成分因子得分矩陣

表7 13批腦安顆粒主成分得分、綜合得分及排序

3 討論

3.1 方法學(xué)條件

研究過程中，采用二極管陣列檢測器(PAD)在190～400 nm全波長進(jìn)行篩選；考察了不同比例和梯度的流動相系統(tǒng)(甲醇、乙腈、水、0.2%磷酸、0.4%冰醋酸、0.5%甲酸)對色譜峰的影響；對柱溫(25、30、35 ℃)、提取溶劑(甲醇、乙醇、75%甲醇、75%乙醇、55%甲醇、55%乙醇)、提取方式(超聲、浸漬過夜、回流)、提取時間(35、45、55 min)、超聲頻率及超聲功率都進(jìn)行考察。通過上述研究，最終選擇分段變換波長檢測法對9種化學(xué)成分進(jìn)行測定并優(yōu)化得到了本研究所需的色譜條件。

3.2 液相色譜儀的考察

本實(shí)驗(yàn)分別考察高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀對腦安顆粒的分析，結(jié)果UPLC相較HPLC不僅大大縮短了分析時間(由80 min縮短到25 min)，而且各主要成分的分離效果更好，能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求，靈敏度和專屬性更強(qiáng)，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3.3 聚類分析和主成分分析

主成分分析是對復(fù)雜信息的多維變量進(jìn)行提取及數(shù)學(xué)降維，生成新的綜合變量的相互獨(dú)立的方法，生成的綜合變量即是主成分。主成分分析法在不損失大量信息的前提下，將高維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成低維數(shù)據(jù)，便于觀察藥物之間的差異性，特別適用于中藥多成分的綜合質(zhì)量評價分析。本研究對13批腦安顆粒樣品中的9種成分含量測定數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和主成分分析，兩者分析結(jié)果一致，13批樣品的9個成分含量存在一定差異，被分為3大類，可以很好識別不同生產(chǎn)廠家的樣品。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，往往是多種藥效成分協(xié)同作用，故多組分含量同時測定更能客觀全面反映中藥制劑的質(zhì)量。本研究建立UPLC同時測量腦安顆粒中的洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯9種成分的含量，與HPLC相比大大縮短了分析時間，且精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合方法學(xué)要求，可為腦安顆粒藥品質(zhì)量評價提供參考。