劉斯琪，彭玉帥，郭麗娜，陶志，王莎，王如峰

北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院，北京 102488

金蓮花為毛莨科多年生草本植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花，由于其具有抗病毒、抗菌、抗炎等藥理活性被廣泛用于治療咽炎、扁桃體炎、急性中耳炎和急性淋巴管炎等疾病[1-3]。金蓮花中的主要化學成分為黃酮類、酚酸類和生物堿類物質[2，4]。其中黃酮類物質中大部分為黃酮碳苷，即黃酮骨架的C-8通過C-C鍵與糖基相連，包括葒草素、牡荊素、異當藥黃素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2?-甲基丁?；?葒草素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、葒草素-6?-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-2″-O-β-L-半乳糖苷(葒草素-6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷)、牡荊素-6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷、金蓮花碳苷Ⅰ～Ⅲ等[5-8]。除此之外還有黃酮氧苷，如槲皮素和異槲皮素[9]。

中藥藥效是多成分多靶點的協同效應和多成分單靶點疊加效應的共同結果，并且中藥的成分需要被吸收入血后才能夠到達相應的靶器官發(fā)揮作用，因此真正起效的應該是血液中的原型成分和代謝產物[10]。目前研究認為，金蓮花中的主要化學成分是黃酮類化合物[11]，但其在體內真正起效的成分依然不明確。鑒于此，本研究采用高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)對金蓮花中5個典型的黃酮類化合物體內代謝產物及代謝途徑進行研究，以期進一步明確金蓮花中所含主要物質在體內的代謝過程，為合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

1525型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；LTQ ORBTTRAP XL型質譜儀(美國Thermo公司)；甲酸、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；1，2-丙二醇、水合氯醛(分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司)；葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、異槲皮素均為本實驗室從金蓮花中提取分離，經HPLC峰面積歸一化法測定其純度均大于98%。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，體質量(200±20) g，由北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2011-0004。實驗前禁食不禁水24 h。

2 方法

2.1 色譜條件

Welch Ultimate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，有預柱；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件分別為葒草素：0～9 min，5%～25%A；9～12 min，25%A；12～17 min，25%～45%A；17～24 min，45%～60%A；24～29 min，60%～80%A；29～31 min，80%～5%A；31～35 min，5%A。葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷：0～12 min，5%～25%A；12～15 min，25%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～70%A；30～32 min，70%～5%A；32～35 min，5%A。牡荊素：0～6 min，5%～15%A；6～16 min，15%～35%A；16～20 min，35%～50%A；20～25 min，50%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素：0～7 min，5%～25%A；7～18 min，25%～55%A；18～25 min，55%～80%A；25～27 min，80%～5%A；27～30 min，5%A。異槲皮素：0～20 min，5%～70%A；20～22 min，70%～5%A；22～25 min，5%A；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2 質譜條件

Accela 600型泵；電噴霧離子源(ESI)；負離子掃描模式；掃描范圍為m/z100～1000；毛細管溫度為350 ℃；毛細管電壓為-35 V；氣化溫度為300 ℃；鞘流氣體積流量為17 L·min-1。

2.3 藥品制備

精密稱定葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，超聲溶解于水中。精密稱定葒草素、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素、異槲皮素，用30% 1，2-丙二醇水溶液超聲溶解。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素、異槲皮素終質量濃度分別為1.60、3.00、1.00、3.00、1.25 mg·mL-1。

2.4 給藥及采血

大鼠隨機分為5組，每組10只，其中5只為給藥組，5只為空白組。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素、異槲皮素分別按照10.00、15.00、6.25、15.00、7.50 mg·kg-1尾靜脈注射給藥，各對照組給予相同體積的蒸餾水，給藥后10 min眼眶靜脈叢取血。

2.5 樣品處理

取血后靜置30 min，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑為11.5 cm)。各組取空白血清和含藥血清各500 μL，分別加入3倍體積的乙腈渦旋混勻，沉淀蛋白，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液1700 μL，于40 ℃氮氣吹干，再用甲醇170 μL復溶。超聲溶解2 min，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

3 結果

各組樣品的HPLC-MS/MS總離子流圖見圖1，原型成分及代謝產物結構式見圖2～3，原型成分及代謝產物的碎片信息見表1～2。

注：A.葒草素組空白血清；A′.葒草素組含藥血清；B.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷組空白血清；B′.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷組含藥血清；C.牡荊素組空白血清；C′.牡荊素組含藥血清；D.2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素組空白血清；D′.2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素組含藥血清；E.異槲皮素組空白血清；E′.異槲皮素組含藥血清。圖1 各組大鼠空白血清和含藥血清的總離子流圖

圖2 金蓮花中5個原型成分結構式

圖3 金蓮花中5個原型成分在大鼠體內的代謝產物結構式

表1 金蓮花中5個原型成分質譜信息

表2 金蓮花中5個原型成分在大鼠體內的代謝產物質譜信息

3.1 葒草素代謝產物

葒草素(m/z447.09)共產生5種代謝產物。代謝產物M1(m/z527.05)存在二級碎片m/z447.12、437.08、407.09，提示其可能為硫酸酯結合產物。代謝產物M2(m/z559.02)存在二級碎片m/z479.15，表明其可能為硫酸酯結合產物，并且根據其相對分子質量、分子式及其他二級碎片可推斷M2在M1的基礎上又發(fā)生了2個位置的羥基化反應。代謝產物M3(m/z623.13)存在二級碎片m/z447.17、533.13、503.08，表明其為葡萄糖醛酸結合產物。代謝產物M4(m/z637.14)存在二級碎片m/z461.20、547.17、517.17，表明其為甲基化和葡萄糖醛酸結合產物，結合位置為黃酮母核。代謝產物M5(m/z461.11)存在二級碎片m/z371.10、341.10，說明其為甲基化產物。

3.2 葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷代謝產物

葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(m/z609.15)共產生2種代謝產物。根據代謝產物M6(m/z447.10)的二級碎片m/z357.19和327.07可推斷M6為O-苷鍵斷裂后產生的葒草素。代謝產物M7(m/z623.17)存在二級碎片m/z443.07和428.17，表明其可能為甲基化產物，m/z371.17和341.03提示甲基結合在黃酮母核上，并且m/z463.23提示發(fā)生了逆狄爾斯-阿德爾反應(RDA)。據此進一步推斷甲基是結合于A環(huán)，又因5-OH的結合能力強于7-OH，推斷結合位置為5-OH。

3.3 牡荊素代謝產物

牡荊素(m/z431.10)共產生3種代謝產物。代謝產物M8(m/z607.13)存在二級碎片m/z431.12，說明發(fā)生了葡萄糖醛酸結合反應；同時碎片m/z558.80、487.20、413.03、311.11進一步證明了此推斷。代謝產物M9(m/z463.09)和M10(m/z463.09)為同分異構體，根據二級碎片及相對分子質量推測兩者均為羥基化產物。兩者存在互補二級碎片m/z287、175，該碎片來源于RDA裂解，據此推斷羥基化發(fā)生于黃酮母核的B環(huán)。

3.4 2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素代謝產物

2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素(m/z515.15)共產生5種代謝產物。代謝產物M11(m/z691.19)存在二級碎片m/z515.29，提示其為葡萄糖醛酸結合產物。代謝產物M12(m/z707.18)存在二級碎片m/z689.21、531.12，表明其為羥基化和葡萄糖醛酸結合產物。代謝產物M13(m/z431.10)和牡荊素具有相同的相對分子質量和二級碎片，表明其為牡荊素。代謝產物M14(m/z607.13)和M15(m/z607.13)為同分異構體，兩者與M8有相同的相對分子質量和許多相同的二級碎片，表明M14和M15在牡荊素基礎上發(fā)生了葡萄糖醛酸結合反應，即2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素去甲基丁?；?，再發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應。

3.5 異槲皮素代謝產物

異槲皮素(m/z463.09)共產生5種代謝產物。代謝產物M16(m/z653.14)、M17(m/z653.14)和M18(m/z653.14)互為同分異構體，均存在二級碎片m/z477，表明三者為葡萄糖醛酸結合產物。m/z477為異槲皮素加1個甲基，表明其為甲基化產物。M18存在二級碎片m/z342.14，表明M18的黃酮母核發(fā)生了RDA裂解，而M16和M17并沒有出現該碎片，提示M18是葡萄糖醛酸結合反應和甲基反應發(fā)生在異槲皮素A環(huán)的產物，M16和M17是2種反應發(fā)生在異槲皮素B環(huán)的產物。代謝產物M19(m/z543.05)存在二級碎片m/z380.94、301.08，提示黃酮母核的1個游離羥基上發(fā)生了硫酸酯結合反應。代謝產物M20(m/z477.11)存在二級碎片462.15，表明其可能為異槲皮素的甲基化結合產物。M20的相對分子質量和二級碎片與文獻報道的異鼠李素-3-O-葡萄糖苷一致[12-13]，故可以確定M20為異槲皮素的3′-OH發(fā)生了甲基化反應的產物。5種黃酮類化合物的代謝途徑見圖4。

注：A.葒草素；B.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖；C.牡荊素；D.2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素；E.異槲皮素。圖4 5個黃酮類化合物的代謝途徑

4 討論

許多代謝產物由于其穩(wěn)定的化學性質及良好的生物活性而比原型成分具有更好的藥效，這些代謝產物就是潛在的活性物質，有重要的研究意義。本研究采用HPLC-MS/MS測定了金蓮花5個主要黃酮類成分的體內代謝產物，發(fā)現未發(fā)生C-苷鍵斷裂的現象，表明黃酮C-苷鍵結構較穩(wěn)定[14]。5個化合物發(fā)生了氧化、甲基化、硫酸酯結合、葡萄糖醛酸結合等Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應，其中葒草素發(fā)生了甲基化、硫酸酯結合和葡萄糖醛酸結合反應等Ⅱ相代謝反應，且硫酸化和甲基化基本不同時發(fā)生，而牡荊素則只發(fā)生了葡萄糖醛酸結合反應。由于牡荊素與葒草素相比在3′位少1個羥基，據此可推測，在黃酮母核B環(huán)的3′和4′位存在羥基時易在3′位發(fā)生甲基和硫酸酯基結合反應，在4′位發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應，該反應能夠增加原化合物的極性，從而利于排泄。

本實驗研究了葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素4種黃酮碳苷及異槲皮素1種黃酮氧苷的代謝產物，發(fā)現除了C-苷鍵難于水解外，異槲皮素連于C環(huán)上的O-苷鍵也不易水解，這與本課題組前期研究結果一致[15]。但葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷連于糖基上的O-苷鍵則發(fā)生了水解。通過靜脈注射給藥后，藥物可以通過血液循環(huán)進入肝臟代謝，因而可以確定連于黃酮母核上的黃酮O-苷鍵不能在肝臟進行水解代謝。結合本實驗室前期對金蓮花代謝產物的研究及相關文獻，發(fā)現黃酮類物質的代謝具有明顯規(guī)律。首先，黃酮氧苷的主要水解代謝發(fā)生在胃腸道中，會被水解為相應的苷和苷元，而黃酮碳苷則主要通過腸道微生物產生的水解酶進行水解代謝[16]；其次，在進入血液循環(huán)后黃酮類物質會在肝臟多種酶的作用下發(fā)生羥基化等Ⅰ相代謝反應和葡萄糖醛酸結合、甲基化、硫酸酯化等Ⅱ相代謝反應，其中葡萄糖醛酸結合反應較易發(fā)生于7-OH位及4′-OH位。除此之外，還會由于肝腸循環(huán)而發(fā)生黃酮母核的A型和B型裂解反應；最后，黃酮類物質可以在肝臟中發(fā)生乙?；磻猍15]，同時帶有?；狞S酮類物質也可以在肝臟中發(fā)生水解反應脫酰基，如2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素。本研究結果為金蓮花黃酮類化合物的體內代謝研究及金蓮花的進一步開發(fā)利用提供了參考。