邵麗麗， 董信芳， 丁霞， 焦瓊杰， 張世梅， 倪倩

兒童急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是5歲以下兒童死亡的第二大病因，而高達(dá)90%的呼吸道感染是由病毒引起[1-2]。呼吸道病毒種類多、感染力強(qiáng)而且傳播速度快，常表現(xiàn)出一定的時(shí)間和地域分布差異。近年來(lái)，隨著各種抗病毒、抗菌藥物和疫苗的廣泛使用、新型呼吸道病毒的發(fā)現(xiàn)以及氣候的改變，部分地域的呼吸道病毒病原譜正在發(fā)生變化。了解并建立局部地域ARTI病毒病原譜，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)2017年10月至2018年9月就診于我院兒科門診的0～14歲急性呼吸道感染兒童鼻咽拭子進(jìn)行病毒檢測(cè)，了解2017～2018年蘭州市ARTI兒童病毒感染譜構(gòu)成及流行特征，為蘭州市兒童急性呼吸道感染的防控及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年10月至2018年9月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院兒科門診收治急性呼吸道感染患兒188例，其中男108例，女80例；年齡5個(gè)月至12歲，中位數(shù)為4歲，≤1歲41例，2～3歲40例，4～5歲60例，6～14歲47例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《臨床診療指南·呼吸病學(xué)分冊(cè)》中急性呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合急性呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≤14歲；(3)病程≤3 d；(4)患兒家屬知情同意，且本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)有肺結(jié)核、哮喘等病史；(2)有明確細(xì)菌感染證據(jù)或病程4 d以上的呼吸道感染；(3)合并其他全身嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者。

1.5 方法 于就診當(dāng)日使用專用病毒采樣管采集鼻咽拭子后加入病毒保存液2 mL內(nèi)，混勻后置于-80 ℃冰箱保存。按實(shí)驗(yàn)方案要求均衡采樣，避免集中采樣，每月樣本不少于13份。提取鼻咽拭子上病毒基因組DNA和總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將上述DNA和cDNA置于-80 ℃保存。具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書，DNA/RNA提取試劑盒(DP315，北京天根生化科技有限公司)。采用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)流感病毒(influenza virus,IFV)A、B型、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses,RSV)A、B型、副流感病毒(parainfluenza virus,PIV) 1～4型、腺病毒(adenovirus,ADV)、人偏肺病毒(human metapneumonia virus,HMPV)、人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)、鼻病毒/人腸道病毒(human rhinovirus/human enterovirus,HRV/HEV)和人冠狀病毒(human coronavirus,HCoV)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增體系包括DNA/cDNA 5 μL，10*緩沖液(buffer) 2 μL，10 mmol/L單脫氧核苷三磷酸0.4 μL，10 μmol/L引物 1 μL/條，5 U/μLTaq酶0.4 μL，焦碳酸二乙酯處理H2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果估計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物濃度，并將產(chǎn)物稀釋10倍后，取1 μL與ROX-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)0.25 μL混勻，95 ℃5 min→迅速冰浴3 min，然后置于ABI3730測(cè)序儀樣本架上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。毛細(xì)管電泳結(jié)果采用Genemarker軟件查看分析。

1.6 觀察指標(biāo) 不同性別、不同年齡段、不同季節(jié)中呼吸道病毒的檢出率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病毒檢出情況 188例患兒咽拭子標(biāo)本中檢出病毒陽(yáng)性者173例，總陽(yáng)性率為92.0%。RSV最常見(jiàn)，64例，陽(yáng)性率為34.0%；其次為IFV，58例(30.9%)；依次遞減為PIV 43例(22.9%)、ADV 36例(19.1%)、HRV/HEV 20例(10.6%)、HCoV 14例(7.4%)、HBoV 6例(3.2%)、HMPV 4例(2.1%)。

2.2 不同性別患兒病毒檢出情況 男性患兒陽(yáng)性率為88.9%(96/108)，女性為96.3%(77/80)，不同性別患兒病毒檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.392，P=0.066)。

2.3 不同年齡段患兒病毒檢出情況 ≤1歲患兒陽(yáng)性率最高，為100.0%(41/41)，依次為6～14歲患兒95.7%(45/47)，2～3歲患兒87.5%(35/40)，4～5歲患兒86.7%(52/60)，各年齡段患兒陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。不同病毒類型各個(gè)年齡段陽(yáng)性率比較見(jiàn)表1。

表1 2017～2018年蘭州市不同年齡ARTI患兒呼吸道病毒陽(yáng)性率比較[n(%)]

表1結(jié)果表明，RSV和HBoV陽(yáng)性率各年齡段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RSV感染者，≤1歲患兒陽(yáng)性率顯著高于4～5歲患兒(χ2=17.385，P<0.001)和6～14歲患兒(χ2=8.568，P=0.003)，但≤1歲患兒與2～3歲患兒陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4～5歲患兒與6～14歲患兒陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBoV感染者，4～5歲患兒與6～14歲患兒陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)，其余各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 不同季節(jié)病毒檢出情況 春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)和冬(12～2月)呼吸道病毒總陽(yáng)性率分別為93.5%(43/46)、83.3%(40/48)、93.3%(42/45)和98.0%(48/49)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)。不同病毒類型不同季節(jié)陽(yáng)性率比較見(jiàn)表2。

表2結(jié)果表明，PIV在冬季陽(yáng)性率顯著高于其他季節(jié)，秋季最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HRV/HEV陽(yáng)性率在冬季最高，春季最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HCoV陽(yáng)性率在冬季最高，夏季最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 不同月份病毒檢出情況 12個(gè)月份中病毒均有檢出，檢出的高峰在2017年11月至次年3月。不同的病毒隨月份變化分布各有特點(diǎn)，ADV在整個(gè)檢測(cè)時(shí)間段均有檢出，高峰在12月份。RSV低谷在6、7月份，其余月份陽(yáng)性率普遍較高。IFV的高峰從晚秋(11月份，53.3%)一直持續(xù)到早春(3月份，43.4%)，在2018年8月和9月出現(xiàn)了小高峰，6月份陽(yáng)性率最低(6.7%)。HRV/HEV主要在11月份至次年2月份檢出，3月份開始下降，6、7月份再次上升。PIV流行月份為12月份到次年3月份，7月份再次出現(xiàn)高峰。HBoV檢出較少，基本集中在9月份至次年3月份。HBoV和HMPV零星檢出，還未看出明顯月份流行趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 2017～2018年蘭州市不同月份ARTI患兒中呼吸道病毒陽(yáng)性率比較

2.6 病毒混合感染情況 188例樣本中≥2種呼吸道病毒感染的有44例，陽(yáng)性率為23.4%(44/188)，包括同時(shí)感染2種病毒25例，占混合感染的56.8%(25/44)，三重感染占29.5%(13/44)，四重與五重感染各3例，占混合感染的6.8%(3/44)。混合感染主要是IFV與其他病毒的共同感染，占混合感染的45.5%(20/44)，其次為RSV與其他病毒的混合感染占36.4%(16/44)。各季節(jié)均有混合感染病例檢出，冬季混合感染率最高，與春、夏季比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?！?歲組混合感染率最高，但與其他組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

ARTI是兒童時(shí)期的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是造成兒童住院和死亡的主要原因之一[4-5]。由于病毒感染是ARTI最主要的病因[1-2,6]，加之病毒流行分布不僅具有季節(jié)性，并且具有地域流行特點(diǎn)，所以了解本地區(qū)病毒感染流行分布特點(diǎn)，對(duì)于提高本地區(qū)ARTI療效、避免抗菌藥物的濫用具有重要意義。

本研究顯示，2017～2018年蘭州市ARTI患兒檢出病毒總陽(yáng)性率為92.02%，高于相近時(shí)期青島(55.71%)[7]、蘇州(49.1%)[8]等多個(gè)地區(qū)，可能是由于蘭州地處西北，氣候干燥，增加了兒童對(duì)呼吸道病毒的易感性。也高于2006～2009年(73.9%)[9]，究其原因，可能與研究方法不同有一定關(guān)系，但是，我們必須注意到，病程≤3 d的急性呼吸道感染主要以病毒感染為主，應(yīng)該避免過(guò)早使用或無(wú)指征使用抗菌藥物。

本研究中2017～2018年蘭州市ARTI兒童急性呼吸道感染病原以RSV陽(yáng)性率最高，依次遞減為IFV、PIV、ADV、HRV/HEV、HCoV、HBoV、HMPV。查閱文獻(xiàn)，蘭州市呼吸道感染患兒病毒感染譜2006～2009年依次為RSV、HRV、HBoV、IFV、PIV、ADV、HMPV和HcoV[9]；2011～2012年依次為RSV、HRV、ADV和HMPV[10]；2012～2015年依次為RSV、IFV、PIV和HRV[11]?？梢?jiàn)，2007～2018年蘭州市ARTI患兒病毒感染陽(yáng)性率排序雖然有波動(dòng)，但是RSV、IFV、PIV、ADV和HRV是主要的感染病毒，2012年以后，IFV、PIV和ADV感染率有增加。然而，RSV多年來(lái)始終是感染率最高的病毒。

RSV感染急性期可出現(xiàn)喘憋及高熱，嚴(yán)重者甚至進(jìn)展為呼吸衰竭，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒期呼吸道RSV感染可致成年期肺功能不可逆下降，并使成年后哮喘發(fā)病率明顯升高[12-13]。本研究中0～3歲兒童是RSV感染主要人群，一年中除了夏季(6、7月份)，其余季節(jié)普遍陽(yáng)性率較高，并且RSV與其他病毒混合感染率高達(dá)36.4%，所以，應(yīng)該高度重視蘭州市ARTI患兒、尤其是0～3歲兒童RSV感染的監(jiān)測(cè)及治療。

本研究中，IFV、PIV、ADV、HRV/HEV和HCoV陽(yáng)性率分別位于第2～6位，但各年齡組間陽(yáng)性率無(wú)顯著差異，說(shuō)明各年齡段兒童都可能被此5種病毒感染；PIV、HRV/HEV和HCoV在冬季陽(yáng)性率顯著高于其他季節(jié)，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PIV感染高峰期在2月、7月和12月，HRV/HEV感染高峰期在1月和2月，HCoV感染高峰期在12月；IFV和ADV陽(yáng)性率無(wú)顯著季節(jié)差異，IFV感染高峰期在2月和11月，ADV感染高峰期在12月。本研究全年檢出HBoV 6例、HMPV 4例，此2種病毒的感染率較低。有學(xué)者報(bào)道病毒陽(yáng)性率隨著年齡增長(zhǎng)呈逐漸下降的趨勢(shì)，年齡越小感染率越高[14]。本研究顯示各年齡組中≤1歲組病毒陽(yáng)性率最高(100.0%)，其次為6～14歲組(95.7%)、2～3歲組(87.5%)、4～5歲組(86.7%)，6～14歲組病毒陽(yáng)性率高于2～3歲組和4～5歲組。6～14歲組感染率增加的原因考慮與學(xué)齡兒童在校人員密集，交叉感染機(jī)會(huì)增多有關(guān)，故而有必要呼吁蘭州市學(xué)校加強(qiáng)對(duì)學(xué)生衛(wèi)生常識(shí)、呼吸道疾病防控知識(shí)的普及。

混合感染是急性呼吸道感染的常見(jiàn)現(xiàn)象，可能與病毒感染后呼吸道上皮細(xì)胞受損導(dǎo)致對(duì)其他病毒的易感性增加有關(guān)[15]。本研究顯示，2017～2018年蘭州市ARTI患兒混合感染率為23.4%(44/188)，主要是IFV或RSV與其他病毒混合感染；各季節(jié)均有混合感染病例檢出，冬季混合感染率最高，夏季最低；≤1歲組患兒混合感染率最高。

綜上所述，2017～2018年蘭州市0～14歲ARTI患兒中：(1)病毒感染總陽(yáng)性率高達(dá)92.02%，提示病程≤3 d的呼吸道感染患兒不應(yīng)該常規(guī)使用抗菌藥物；(2)RSV陽(yáng)性率最高，其次依次為IFV、PIV、ADV、HRV/HEV、HCoV、HBoV、HMPV，IFV和PIV近年來(lái)呈明顯的上升趨勢(shì)；(3)要高度重視蘭州市ARTI患兒、尤其是0～3歲患兒RSV感染的監(jiān)測(cè)及治療；(4)RSV、IFV和ADV陽(yáng)性率無(wú)顯著季節(jié)差異，而PIV、HRV/HEV和HCoV在冬季陽(yáng)性率顯著高于其他季節(jié)；(5)6～14歲組患兒病毒陽(yáng)性率高于學(xué)齡前兒童，需要加強(qiáng)學(xué)校呼吸道疾病防控知識(shí)宣教；(6)≤1歲組患兒混合感染率最高，宜密切觀察病情變化。由于本研究中患兒病例數(shù)有限，只能部分說(shuō)明蘭州市ARTI患兒病毒病原譜的變化，未來(lái)應(yīng)該聯(lián)合多中心進(jìn)行大樣本研究，持續(xù)監(jiān)測(cè)ARTI患兒呼吸道病毒病原譜的變化，可為本地區(qū)兒童呼吸道感染疾病的臨床診治和預(yù)防策略的制訂提供更加科學(xué)的參考依據(jù)。