肖 峰，閔 潔,2，張雨晨，刁婷婷,3，周其其，要 輝，張 蒙，閔 清**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.陽新縣人民醫(yī)院；3.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院)

山楂葉為薔薇科植物山里紅的干燥葉，據(jù)2015年版的《中國藥典》報(bào)道，山楂葉酸味，具有調(diào)節(jié)氣血、減少渾濁和降低脂質(zhì)等作用[1]。山楂葉總黃酮(HLF)主要成分包含黃體素、黃體素鼠李糖苷等[2]，具有冠狀血管擴(kuò)張、保護(hù)心肌缺血、改善心肌供血和降低血脂的療效，具有重要的藥用價(jià)值[3]。

高脂血癥(hyperlipidaemia，HLP)是血脂水平異常所引起的疾病，近年來HLP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平過高，可伴隨高密度脂蛋白(HDL-C)水平過低。這種情況的發(fā)生與生活方式和不良的飲食習(xí)慣有關(guān)，是心血管疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[4]。

本課題研究通過建立穩(wěn)定可靠的HLP動(dòng)物模型，觀察HLF對(duì)HLP大鼠血漿血脂、生化指標(biāo)含量的影響，分析心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，研究HLF對(duì)HLP大鼠心臟的影響及其可能的機(jī)制，為探索HLF的降脂作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重160～200g。

1.2 藥品與儀器

藥品：含量為93.5%的HLF(批號(hào)AKH15-3，購于臨沂愛康藥業(yè)有限公司)；HDL-c試劑盒(批號(hào)20180817)、LDL-c試劑盒(批號(hào)20180816)、CK(批號(hào)20190717)、LDH(批號(hào)20190717)、SOD(批號(hào)20201104)、MDA(批號(hào)20200927)、GSH(批號(hào)20200118)、GSH-px(批號(hào)20201118)、NEFA(批號(hào)20201107)均購買于南京建成生物工程研究所；eNOS抗體(產(chǎn)品批號(hào):bs-20608R)、p-eNOS抗體(產(chǎn)品批號(hào):bs-3589R)、GAPDH抗體(產(chǎn)品批號(hào):bs-10900R)均購買于博奧森試劑有限公司；AMPK抗體(產(chǎn)品批號(hào):AF1627)、p-AMPK抗體(產(chǎn)品批號(hào):AF2677)購于碧云天公司。

儀器：PGH-40-AS超純水機(jī)(武漢品冠儀器設(shè)備有限公司)；電子分析天平(德國Sartorius公司)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan Spark公司)；電腦生物組織脫水機(jī)(YAGANG)；石蠟包埋機(jī)(YAGANG)；石蠟切片機(jī)(美國Thermo)；正置熒光顯微鏡(德國Leica)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂Chemi-Doc)；TGL-20M低溫高速離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀(武漢塞維爾物科技有限公司)；Western blot電泳儀與轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

用隨機(jī)數(shù)的方法，將48只雄性SD大鼠分為空白組、模型組、辛伐他汀對(duì)照組、HLF低、中、高劑量組，每組各8只。

參考李偉強(qiáng)等[5]的方法，制備HLP大鼠模型，將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，空白組SD大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，其余各組則用高脂飼料喂養(yǎng)，造模共8周。在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，各組SD大鼠給予藥物進(jìn)行干預(yù)：按照人-動(dòng)物劑量換算表，各組藥物進(jìn)行劑量換算，對(duì)照組灌胃辛伐他汀，劑量為8mg/kg，HLF低、中、高劑量組分別給予HLF，劑量依次為100、200、400mg/kg，空白組和模型組給予蒸餾水1mL/100g，1次/d，采取灌胃給藥方式，連續(xù)8周。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

最后一次給藥后，禁食不禁水12h，烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4℃溫度條件下，按3 500r/min的轉(zhuǎn)速，離心15min，吸取上清收集血漿，頸椎脫臼處死大鼠，解剖摘取心臟。取各組血漿，按照試劑盒說明書方法，測(cè)定大鼠血漿中的血脂指標(biāo)TC、TG、NEFA和氧化炎癥損傷指標(biāo)CK、LDH、GSH、GSH-px、MDA、SOD含量，觀察HLF對(duì)HLP大鼠血脂的影響及對(duì)高脂模型炎癥損傷的保護(hù)作用。

1.5 HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變

將大鼠心臟心尖組織分離，切大小合適的塊狀組織，用4%多聚甲醛緩沖液固定48h，制作病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.6 Western blot蛋白分析

將大鼠心臟組織加入裂解液，使其裂解完全，在4℃，12 000r/min的條件下離心15min，吸取上清液。按BCA試劑盒方法，測(cè)上清液蛋白濃度，調(diào)整好上清液蛋白濃度，加入buffer、裂解液變性制成上樣液，進(jìn)行上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后奶粉封閉1h，4℃孵育一抗過夜，TBST洗3次。室溫孵育二抗1.5h，TBST洗3次。最后凝膠成像，分析蛋白條帶數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物體征

空白組：毛發(fā)干凈順滑，飲食、體重正常，精神尚可。模型組：毛發(fā)粗糙發(fā)黃，精神較差。其余各給藥組：生長較為正常，體重有所增長，精神尚可。

2.2 HLF對(duì)HLP大鼠血漿生化指標(biāo)的影響

各組大鼠血漿血脂中TG、TC以及LDL-C含量數(shù)據(jù)詳情見前期研究結(jié)果[6]，說明HLP的SD大鼠模型建立成功。本文與其共用同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，由表1可知，模型組大鼠血漿中CK、LDH、MDA、NEFA水平明顯高于空白組，SOD、GSH-PX、GSH水平明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明模型組大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重。與模型組比較，HLF高劑量組和辛伐他汀對(duì)照組均可顯著降低大鼠血漿中CK、LDH、MDA、NEFA水平而升高GSH、GSH-px、SOD水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且低、中、高劑量組存在一定劑量依賴，但組間差異不顯著。

表1 HLF對(duì)HLP大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響

2.3 HLF對(duì)HLP大鼠心臟病理變化的影響(HE染色)

結(jié)果顯示，空白組正常心肌組織橫紋肌條理清晰，質(zhì)地緊密有規(guī)則，未見明顯心肌細(xì)胞增厚和炎性組織浸潤；與空白組對(duì)比，模型組心肌組織橫紋肌出現(xiàn)較多明顯不規(guī)則褶皺、空泡及明顯炎性浸潤組織；與模型組比較，HLF低、中、高劑量組和辛伐他汀對(duì)照組心肌組織橫紋肌結(jié)構(gòu)較為清晰，不規(guī)則褶皺、空泡間隙和炎性浸潤明顯減輕，見圖1(封二)。

2.4 HLF對(duì)HLP大鼠心臟AMPK、eNOS蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，模型組AMPK、p-AMPK/AMPK蛋白比空白組表達(dá)量低(P<0.01)；辛伐他汀對(duì)照組和HLF組AMPK蛋白表達(dá)量與模型組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但辛伐他汀對(duì)照組及HLF高劑量組p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且低、中、高劑量組明顯存在一定劑量依賴，但組間差異不顯著。

與空白組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01A．空白組；B．模型組；C．辛伐他汀對(duì)照組；D．HLF低劑量組；E．HLF中劑量組；F．HLF高劑量組圖2 各組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)情況

由圖3可知，與空白組相比，模型組eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；辛伐他汀對(duì)照組、HLF給藥各組的eNOS蛋白與模型組比表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；辛伐他汀對(duì)照組及HLF高劑量組p-eNOS/eNOS蛋白與模型組比表達(dá)量升高(P<0.05)，且低、中、高劑量組明顯存在一定劑量依賴，但組間差異不顯著。

與空白組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01A．空白組；B．模型組；C．辛伐他汀對(duì)照組；D．HLF低劑量組；E．HLF中劑量組；F．HLF高劑量組圖3 各組大鼠心肌組織p-eNOS/eNOS蛋白表達(dá)情況

3 討 論

近年來，隨著居民飲食中脂肪攝入的增加，異常的血脂和繼發(fā)性問題已成為多種心血管疾病的危險(xiǎn)因素[7]，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病等，它已成為世界上人類健康的“第一殺手”[8]。由于西藥的副作用和患者的不耐受性，導(dǎo)致人們對(duì)中藥越發(fā)感興趣。中藥優(yōu)點(diǎn)主要是價(jià)格便宜，來源廣泛，且天然無毒副作用[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為山楂能降血脂、降血壓，山楂的總黃酮能降低膽固醇；大黃能降血脂、活血化瘀、增強(qiáng)腸胃道的蠕動(dòng)，促進(jìn)膽固醇的排泄及減少膽固醇的吸收；虎杖也能清熱瀉火、通便解毒，降甘油三酯[10]，許多中藥都能降低膽固醇，且未見明顯不良反應(yīng)。

高游離脂肪酸(FFA)是導(dǎo)致代謝綜合征患者心血管內(nèi)皮功能異常的重要因素。研究表明[11]，其可通過激活炎癥分子途徑來損害心血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能；而且游離脂肪酸可以抑制AMPK-eNOS途徑，并對(duì)心血管內(nèi)皮造成一定損害，證明游離脂肪酸具有很強(qiáng)的脂毒性。

習(xí)婷婷等[6]通過建立HLP SD大鼠模型，測(cè)定各組SD大鼠的血漿中TC、TG、LDL-c的含量，確定HLP的SD大鼠模型建立成功，并證明HLF有調(diào)節(jié)血脂含量的作用。我們又測(cè)定各組SD大鼠的血漿中MDA、CK、LDH、NEFA的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組大鼠血漿中CK、LDH、MDA、NEFA水平明顯高于空白組，SOD、GSH-PX、GSH水平明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型組大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重。與模型組比較，HLF高劑量組和辛伐他汀對(duì)照組均可顯著降低大鼠血漿中CK、LDH、MDA、NEFA水平而升高GSH、GSH-px、SOD水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明HLF具有調(diào)血脂、降低游離脂肪酸、提高機(jī)體抗氧化能力的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法通過AMPK-eNOS信號(hào)通路對(duì)HLF產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用可能的機(jī)制進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組p-AMPK/AMPK和eNOS/p-eNOS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，而與模型組相比，高劑量的HLF大鼠p-AMPK/AMPK和p-eNOS/eNOS的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，提示HLF通過AMPK-eNOS信號(hào)通路來調(diào)節(jié)HLP的心肌損傷作用。

綜上所述，HLF可以調(diào)節(jié)血脂水平，降低游離脂肪酸含量，調(diào)節(jié)激活體內(nèi)AMPK-eNOS信號(hào)，進(jìn)而起到抗炎、抗氧化損傷的作用。