姜 悅，代圣潔，姜志龍，馬雪芹，張又枝

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種多病因但幾乎無長期過量飲酒史的慢性肝臟疾病,主要臨床表現(xiàn)為肝臟脂質(zhì)異常蓄積和脂肪細(xì)胞的變性[1]。NAFLD與代謝綜合征(metabolic syndrome,MetS)、2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)、動脈硬化性心血管疾病的高發(fā)密切相關(guān)。雖然NAFLD不是代謝綜合征的一個(gè)組分，但研究表明其與心血管疾病例如動脈粥樣硬化的發(fā)生高度相關(guān)[2]。

二甲雙胍(metformin)是植物法國丁香的提取物，屬于雙胍類抗高血糖藥，可以降低空腹血糖[3]。自1957年被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)在臨床中應(yīng)用了半個(gè)世紀(jì)，在我國也已有近20年的使用史[4]。二甲雙胍外用藥可以有效預(yù)防由前期糖尿病原因引起的各種臨床并發(fā)癥，降低患者血漿中的胰島素膽固醇水平，從而減少對胰島素的抵抗，所以是臨床上治療Ⅱ型糖尿病最常用的藥。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道二甲雙胍除了降糖作用，還具有抗腫瘤、抗炎及抗衰老作用，也有研究[6]表明二甲雙胍對血管及心臟有保護(hù)作用、對多囊卵巢有治療作用，可明顯改善NAFLD患者的肝臟病理狀態(tài)，使其血脂水平降低和磷酸轉(zhuǎn)氨酶水平下降。但還沒有研究表明二甲雙胍對頸部動脈粥樣硬化合并NAFLD小鼠的作用。因此，我們在ApoE基因敲除小鼠中形成腹主動脈動脈粥樣硬化和NAFLD，再通過頸總動脈部分結(jié)扎(partial carotid ligation,PCL)手術(shù)形成頸部動脈粥樣硬化，觀察二甲雙胍對頸部動脈斑塊合并NAFLD小鼠的肝臟脂肪病變是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸二甲雙胍(阿拉丁，5g，M107827)；蘇木素染液(武漢塞維爾生物科技有限公司，100mL，G1004-100)；伊紅染液(武漢塞維爾生物科技有限公司，100mL,G1001-100)；高脂飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性ApoE基因敲除小鼠20只(22～25g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)；分為4組，具體分組和給藥途徑如下。

高脂對照組(Con組)：5只，每天給予高脂飼料。

二甲雙胍組(Met組)：5只，每天二甲雙胍灌胃300mg/kg，并給予高脂飼料。

PCL手術(shù)組(PCL組)：5只，給予高脂飼料14d后，并對左側(cè)頸總動脈(LCA)進(jìn)行PCL手術(shù)。

PCL+二甲雙胍組(PCL+Met組)：5只，給予高脂飼料，灌胃二甲雙胍(300mg/kg，1次/d)14d后，做PCL手術(shù)，手術(shù)后繼續(xù)灌胃二甲雙胍(300mg/kg，1次/d)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)

記錄小鼠體重的變化及飼料的消耗情況，于小鼠飼養(yǎng)7周后眼球取血，處死，解剖并取頸動脈血管和肝臟組織，置于4%多聚甲醛的EP(10mL)管中固定，采用油紅O和蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測小鼠頸動脈血管和肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化，顯微鏡下觀察拍照。

非酒精性脂肪性肝病的病理組織學(xué)診斷參考2010年中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》，具體計(jì)分見表1。

表1 非酒精性脂肪性肝病變性程度計(jì)分表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠手術(shù)后7周體重的變化

首先觀察各組小鼠精神狀態(tài)和體重改變情況。如圖1所示，與Con組相比較，Met組體重明顯下降(P<0.01)；與PCL組相比較，PCL+Met組體重減輕較為明顯(P<0.01)。上述結(jié)果表明，Met組在手術(shù)后7周都可減輕小鼠體重，對PCL組也有同樣的作用。

圖1 各組小鼠手術(shù)后7周體重的變化(**P<0.01)

2.2 各組小鼠手術(shù)后7周高脂飼料消耗的變化

由于體重的變化可能與高脂飼料攝入量有關(guān)。因此，我們觀察PCL手術(shù)后7周中，各組小鼠高脂飼料攝入的變化情況。如圖2所示，與對照組相比較，Met組飲食下降(P<0.05)，與PCL組相比較，PCL+Met組飲食明顯下降(P<0.01)。上述結(jié)果表明，Met可以抑制小鼠的食欲。而PCL手術(shù)后對小鼠食欲幾乎沒有影響。

圖2 各組小鼠手術(shù)后7周高脂飼料的消耗情況(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 各組小鼠血管中脂質(zhì)含量的變化

為了評估二甲雙胍對小鼠頸動脈血管中脂質(zhì)斑塊沉積的影響。我們分離小鼠LCA和RCA并進(jìn)行冰凍切片，油紅O染色，對其定量分析。形態(tài)結(jié)果如圖3(封二)顯示，對照組血管結(jié)構(gòu)完整，血管彈力膜清晰可見，有少量脂質(zhì)。Met組血管結(jié)構(gòu)完整，血管彈力膜清晰可見，脂質(zhì)區(qū)域不明顯。PCL組血管中膜和內(nèi)膜界限不明顯，血管中脂質(zhì)區(qū)域面積很大。PCL+Met組血管彈力膜清晰可見，中膜內(nèi)膜界限模糊，血管中脂質(zhì)區(qū)域面積較大如圖3A；對LCA定量分析表明，與PCL組相比，給予二甲雙胍后LCA中脂質(zhì)面積顯著降低(P<0.01)，如圖3B。表明二甲雙胍可以減少血管中脂質(zhì)含量。

2.4 各組小鼠手術(shù)后7周肝臟形態(tài)學(xué)的變化

小鼠手術(shù)后繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)7周后，通過HE染色，結(jié)果如圖4(封二)所示。與對照組相比較，Met組肝臟脂肪性、空泡樣病變減輕。與PCL手術(shù)組比較，PCL+Met組肝臟空泡樣病變有所緩解。如表2所示，與對照組相比，Met組小鼠肝臟脂肪變程度減輕(P<0.05)，與PCL組相比，PCL+Met組小鼠肝臟脂肪變程度減輕(P<0.05)。上述結(jié)果表明，二甲雙胍能減輕高脂飼料引起的肝臟脂肪樣病變，也減輕高脂飼料和PCL手術(shù)引起的肝臟脂肪樣病變。

表2 四組小鼠脂肪病變程度分級

3 討 論

NAFLD是指除酒精和其他明確的損肝因素外，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。在各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的NAFLD患者中，脂質(zhì)的代謝紊亂和異常積累是最常見和最重要的病理學(xué)改變。在動脈粥樣硬化的患者中，通常都伴隨著高脂血癥、脂質(zhì)代謝異常的發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道ApoE基因敲除小鼠是研究高脂、高糖及動脈粥樣硬化的理想模型，也有研究表明ApoE基因敲除小鼠給予高脂飲食，伴隨著身體質(zhì)量的脂肪增加以及腹部脂肪的增加，呈現(xiàn)出較為明顯的“啤酒肚”[5]。頸總動脈部分結(jié)扎手術(shù)形成的頸動脈斑塊可以加速動脈粥樣硬化模型的形成，也可作為動脈粥樣硬化亞臨床表現(xiàn)的一個(gè)方式[7]。

二甲雙胍對NAFLD有改善作用，在臨床中二甲雙胍經(jīng)常與其他藥物輔助治療脂肪肝，以增加其療效。ApoE基因敲除小鼠由于ApoE基因的敲除，導(dǎo)致其他脂類代謝物質(zhì)在體內(nèi)和進(jìn)入肝臟沉積，從而直接導(dǎo)致NAFLD的形成[8]。

二甲雙胍可以通過調(diào)節(jié)下丘腦中GDF15的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的厭食反應(yīng)，達(dá)到控制食物的攝取目的。Gontier等[9]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以調(diào)節(jié)腸道菌群的代謝，影響腸道對葡萄糖的吸收，減少機(jī)體的能量攝入。二甲雙胍可以通過改變NAFLD小鼠肝臟編碼轉(zhuǎn)錄組和非編碼RNA，從而阻礙非酒精性脂肪肝的發(fā)生[10]。Handzlik等[11]通過對非酒精性脂肪肝患者的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能有效減輕肝脂肪變性和肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)也在整體水平上證明了二甲雙胍減少動物對食物的攝取，小鼠肝組織HE染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞脂肪變性以及炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少。

綜上所述，二甲雙胍對ApoE基因敲除小鼠頸動脈及肝臟內(nèi)脂肪沉積具有潛在的保護(hù)作用。雖然目前的研究未能明確二甲雙胍是如何減少肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤，但表明二甲雙胍可能是治療頸動脈粥樣硬化合并NAFLD的一個(gè)潛在的藥物，這為頸動脈粥樣硬化患者NAFLD病變提供了一種新的治療策略。