張博華，張 明，范 祺，王崇隊，楊立風(fēng)，孟曉峰，馬 超

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

食用菌多糖是存在于食用菌中的重要活性分子，是一類具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、降血糖[4]、抑菌[5]等獨特生理活性的天然大分子化合物。大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata），別名皺環(huán)球蓋菇、酒紅色球蓋菇或斐氏球蓋菇，是一種珍稀的食用菌。大球蓋菇口感極佳，顏色誘人，富含多種對人體有益的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素以及多糖[6]，其提取的大球蓋菇多糖對增強機體免疫力有非常重要的作用，大球蓋菇多糖具有抗氧化作用，并對病毒腫瘤等疾病有有效作用[7]。金針菇被稱為益智菇，金針菇多糖是金針菇中主要生物活性成分，具有抗氧化等多種生物活性[8]。香菇多糖（lentinan，LNT）是從香菇子實體中浸提得到的一種含支鏈分子的多糖，它的主要成分是β-(1→3)-D-葡聚糖，是具有抗氧化等生物活性的大分子物質(zhì)[9]。

近年來，人們越來越多地認(rèn)識到食用菌多糖的多種功能，其在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用也越來越廣泛。中國食用真菌種類繁多，具有很大的研究空間[10]。近年來，食用菌多糖也正由單獨應(yīng)用研究向多糖與多糖間的協(xié)同效應(yīng)研究轉(zhuǎn)變[11]。本研究結(jié)合食用菌多糖在抗氧化方面的應(yīng)用，以大球蓋菇、金針菇、香菇為原料，提取其多糖，對食用菌單一多糖及其組成的復(fù)合多糖抗氧化活性與體外降血糖作用進(jìn)行評價，以期為食用菌資源的利用、多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

大球蓋菇、金針菇、香菇，均購于山東恒寶食品集團有限公司。

1.1.2 試劑與儀器

無水乙醇、水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、H2O2、三氯乙酸，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；DPPH，麥克林試劑有限公司提供。

SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇杰瑞爾電器有限公司；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA 公司；FC 酶標(biāo)儀，Thermo 公司儀器有限公司；BG2-240 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；KQ-250B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5A 低速大容量多管離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；KDM 型調(diào)溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三種食用菌多糖的制備

（1）三種食用菌粗多糖提取

分別取大球蓋菇、金針菇、香菇的干制品打粉過60目篩，將粉碎后的物料用超聲輔助熱水浸提法提取，于90 ℃水中提取3 h，冷卻后于5 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液進(jìn)行減壓濃縮至固形物含量為8%左右，將濃縮液、無水乙醇按照體積比1∶4 比例混合，混勻，密封，靜置過夜后抽濾，絮狀物即為粗多糖，將其凍干稱量質(zhì)量后備用[12]。將三種多糖分別配置成2 mg/mL 的水溶液作為三種多糖溶液備用。將三種提取凍干后所得的多糖按照質(zhì)量比1∶1∶1 的比例混合后，制成2 mg/mL 的水溶液作為復(fù)合多糖溶液備用。

（2）Sevage 法脫蛋白制取澄清多糖溶液

取粗多糖干品，用少量水溶解，按比例加入Sevage試劑（V樣品∶V氯仿∶V正丁醇=100∶20∶4），密封后超聲處理15 min，4 000 r/min 離心15 min，收集上清液，除去底層的有機溶劑和中間的變性蛋白。再次加入Sevage 試劑，重復(fù)4～6 次至無白色沉淀為止，得到澄清的多糖溶液[13]。

1.2.2 食用菌多糖抗氧化活性分析

（1）DPPH·清除能力測定

準(zhǔn)確稱取DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品2.56 mg，用無水乙醇定容至100 mL，使其濃度為6.5×105mol/L。樣品管中分別加入0.5mL、2 mg/mL 樣品溶液、2.5 mLDPPH，避光反應(yīng)30 min，0.5 mL 蒸餾水和2.5 mL 乙醇混勻做零管，于515 nm 處測定吸光度A樣品。蒸餾水代替樣品溶液按上述處理測定吸光度為A空白，用無水乙醇乙醇代替DPPH 按上述處理測定吸光度為A對照，DPPH·自由基清除率按照公式（1）計算得出[14]。

（2）·OH 清除能力測定

FeSO4和H2O2反應(yīng)生成·OH，后者能夠氧化水楊酸，其產(chǎn)物在510 nm 處有吸光值，吸光值大小與·OH 成正比。樣品管內(nèi)依次加入0.2 mL、2 mg/mL 樣品溶液，1 mL、0.15 mmol/L 的FeSO4，1 mL、6 mmol/L H2O2，0.4 mL、2 mmol/L 的水楊酸和0.4 mL 蒸餾水。37 ℃水浴1 h，冷卻后以蒸餾水調(diào)零，于510 nm 處測定其吸光度為A樣品，蒸餾水代替水楊酸按上述處理測定吸光度為A對照，用蒸餾水代替樣品溶液測得A空白，以Vc 作為陽性對照按上述處理測定吸光度，·OH 清除率按照公式（2）計算得出[15]。

1.2.3 食用菌多糖體外降血糖作用研究

（1）體外α-葡萄糖苷酶活性抑制作用研究

取400 μL、2 mg/mL 的樣品溶液加入到96 孔板中，然后加入400 μL、100 U/mL 的α-葡萄糖苷酶，混勻，37℃孵育10 min，加入200 μL、7.5 mmol/L PNPG，用檸檬酸溶液調(diào)至pH 4 左右，37 ℃孵育30 min，最后加入1 mol/L Na2CO3溶液1.5 mL 結(jié)束反應(yīng)，于410 nm 波長下測定其吸光度[16]。

（2）體外α-淀粉酶活性抑制作用研究

取多只試管，分別加入1.5 mL、8 mg/mLα-淀粉酶溶液、50 μL PBS 緩沖液（pH 6.1）、50 μL 檸檬酸緩沖液（pH 5.6），依次加入300 μL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的樣品溶液，渦旋混勻，于37 ℃水浴中孵育10 min，分別加入100 μL、1%淀粉溶液，渦旋混勻，于37 ℃水浴中恒溫30 min，加入375 μL DNS 試劑，渦旋混勻，100 ℃沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，與蒸餾水按照1∶4 稀釋混勻，分別于473 nm 波長處測定其吸光度[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0 等分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗結(jié)果均為3 次試驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌多糖的制備

圖1 三種食用菌多糖得率Fig.1 Extraction rate of polysaccharides from three edible fungi

通過上述1.2.1 的提取方法進(jìn)行三種食用菌多糖，大球蓋菇多糖得率為8.58%、金針菇多糖得率為4.71%、香菇多糖得率為6.26%。

2.2 食用菌多糖抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH·清除能力

DPPH 是一種穩(wěn)定的在517 nm 處有強吸光度的氮中心自由基，它可與自由基清除劑電子配對而使吸光度下降，下降程度與電子數(shù)量成正比，故而被廣泛用于食用菌等多糖抗氧化活性的檢測[18]。三種食用菌多糖及復(fù)合多糖的DPPH 自由基清除率見圖2。

圖2 三種食用菌多糖及復(fù)合多糖DPPH 自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of three kinds of edible fungus polysaccharides and compound polysaccharides

由圖2 可知，三種食用菌多糖均具有一定的DPPH自由基的清除能力，當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL 時，復(fù)合食用菌多糖對DPPH 自由基的清除率為60.4%，明顯高于其他三種單一多糖，是金針菇多糖清除率的1.33 倍。同時，大球蓋菇多糖的DPPH 自由基的清除率最高為57.44%，優(yōu)于香菇多糖50.1%。張志超等[19]在試驗中也得出結(jié)論，四種食用菌多糖濃度在2.5 mg/mL 時，復(fù)合食用菌多糖（猴頭菇多糖∶平菇多糖∶香菇多糖∶杏鮑菇多糖=1∶1∶1∶1）的DPPH·清除能力遠(yuǎn)高于單一品種多糖的清除能力。

2.2.2 ·OH 清除能力

羥基自由基具有較強的氧化活性，可造成生物體的過氧化損傷，通常被認(rèn)為是有害自由基，·OH 清除能力廣泛用于評價樣品抗氧化能力[20]。三種食用菌多糖及復(fù)合多糖·OH 清除率見圖3。

圖3 三種食用菌多糖及復(fù)合多糖·OH 清除率Fig.3 ·OH radical scavenging capacity of three kinds of edible fungus polysaccharides and compound polysaccharides

由圖3 可知，當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL 時，大球蓋菇多糖、金針菇多糖、香菇多糖均具有一定的·OH 清除能力，其·OH 清除能力為香菇多糖的＞大球蓋菇多糖＞金針菇多糖。復(fù)合食用菌多糖的·OH 清除率為37.26%，是金針菇多糖的1.18 倍，說明復(fù)合多糖的·OH 清除率優(yōu)于單一食用菌多糖，李俊麗等[21]認(rèn)為原因在于多糖鏈?zhǔn)谴蠓肿娱L鏈，在氫鍵的作用下當(dāng)溶液中存在2 種或者幾種不同多糖的大分子長鏈時，會導(dǎo)致不同多糖鏈之間產(chǎn)生相容性，從而引起構(gòu)象的改變，在這個過程中，多糖的C—H鏈快速與·OH 發(fā)生反應(yīng)而結(jié)合成水，大大減少了·OH 自由基在體系中的量，這對復(fù)合食用菌多糖的開發(fā)利用具有極其重要的指導(dǎo)意義。倪焱等[22]對兩種常用食用菌平菇與香菇與金針菇的多糖化合物通過復(fù)配，并研究了其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)平菇多糖與金針菇多糖濃度為0.2 mg/mL，配比為1∶1 時，·OH 清除率比單一的金針菇多糖、平菇多糖分別高18.0%、32.6%。且隨著濃度的上升，清除率也在逐漸增加，濃度1.0 mg/mL 達(dá)到最高，為92.2%，比金針菇多糖高出了24.0%。

2.2.3 還原能力

抗氧化產(chǎn)品通過還原作用釋放電子來清除自由基，還原力與抗氧化性能成正比，故而還原能力可作為評價樣品抗氧化性能的指標(biāo)。采用鐵氰化鉀來測定樣品還原力，樣品與Fe3+反應(yīng)生成Fe2+，在700 nm 處后者含量與吸光度值呈正相關(guān)[23]。三種食用菌多糖及復(fù)合多糖還原力見圖4。

圖4 三種食用菌多糖及復(fù)合多糖還原力分析Fig.4 Total reducing power of three kinds of edible fungus polysaccharides and compound polysaccharides

如圖4 所示，大球蓋菇多糖、金針菇多糖、香菇多糖均具有一定的還原力，且金針菇多糖＞大球蓋菇多糖＞香菇多糖。而復(fù)合多糖的還原力最強，是香菇多糖的1.55倍。張志超等[19]研究表明四種食用菌多糖猴頭菇多糖、平菇多糖、香菇多糖、杏鮑菇多糖按照1∶1∶1∶1 復(fù)配后，在濃度為2.5～10 mg/mL 時復(fù)合食用菌多糖的還原力高于單一品種多糖的還原力。

2.3 食用菌多糖體外降血糖作用研究

2.3.1 不同食用菌多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率

圖5 三種食用菌多糖及復(fù)合多糖對α-糖苷酶抑制率的分析Fig.5 α-glycosidase inhibitory ability of polysaccharides three kinds of edible fungus polysaccharides and compound polysaccharides

在Ⅱ型糖尿病治療的早期，我國糖尿病防治指南推薦的一線藥物是α-葡萄糖苷酶抑制劑。它是以延緩腸道碳水化合物吸收而達(dá)到降低餐后高血糖的口服降糖藥，其作用特點是在糖消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖[24]。在多糖濃度為2 mg/mL 食用菌多糖對α-糖苷酶抑制作用結(jié)果見圖6，由圖6 可知，三種單一食用菌多糖均有一定的α-糖苷酶抑制作用，且α-糖苷酶抑制率為香菇多糖＞大球蓋菇多糖＞金針菇多糖。復(fù)合食用菌多糖的α-糖苷酶抑制率是金針菇多糖的1.18 倍，均大于單一品種的食用菌多糖，呈現(xiàn)一定的多糖協(xié)同作用。

2.3.2 不同食用菌老莖多糖對α-淀粉酶的抑制率研究

α-淀粉酶抑制劑能延緩食物淀粉在腸道中的消化，抑制餐后血糖水平的升高，其作用機制是通過抑制胃腸道內(nèi)唾液、胰淀粉酶活性，從而起到降低糖尿病患者餐后高血糖、高血脂作用，有利于Ⅱ型糖尿病患者的飲食治療[25]。在多糖濃度為2 mg/mL 食用菌多糖對α-淀粉酶抑制作用結(jié)果見圖6，由圖可知，三種單一食用菌多糖均有一定的α-淀粉酶抑制作用，且α-淀粉酶抑制率為香菇多糖＞大球蓋菇多糖＞金針菇多糖。復(fù)合食用菌多糖的α-淀粉酶抑制率是金針菇多糖的1.2 倍，大于單一品種的食用菌多糖，呈現(xiàn)一定的多糖協(xié)同作用。

圖6 三種食用菌多糖及復(fù)合多糖對α-淀粉酶抑制率的分析Fig.6 α-amylase inhibitory ability of polysaccharides three kinds of edible fungus polysaccharides and compound polysaccharides

3 討論

大球蓋菇、金針菇和香菇都有很厚的真菌細(xì)胞壁，直接用熱水浸提效果有限，而使用超聲波輔助進(jìn)行處理，既可以進(jìn)行物理破壁又不會破壞多糖的生物活性。多糖提取率最高，大球蓋菇、金針菇、香菇三種食用菌多糖的提取率分別為8.58%、4.71%、6.26%。

三種真菌多糖均具有抗氧化和降血糖的作用，復(fù)合多糖的抗氧化能力與降血糖能力均優(yōu)于單一品種多糖。多糖是長鏈大分子化合物，在氫鍵的作用下當(dāng)溶液中存在2 種或者幾種不同多糖的大分子長鏈時，會導(dǎo)致不同多糖鏈之間產(chǎn)生相容性，從而引起構(gòu)象的改變，進(jìn)而引發(fā)反應(yīng)，提高了抗氧化活性。復(fù)合食用菌多糖濃度均為2 mg/mL 時，復(fù)合多糖的DPPH 清除率、羥自由基清除率、還原力分別達(dá)到60.4%、37.26%與0.31，實驗表明復(fù)合多糖可表現(xiàn)出良好的正協(xié)同性。同時以α-糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率來表征多糖的體外降血糖作用，結(jié)果顯示復(fù)合多糖的降血糖能力也優(yōu)于單一品種多糖，復(fù)合食用菌多糖濃度為2 mg/mL 時，α-糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分別為42.26%和50.01%。食用菌菌絲多糖抗氧化活性不同，表明不同食用菌中含有的多糖種類不同，以致抗氧化能力不同。復(fù)合多糖中存在多種多糖，不同多糖結(jié)合不同自由基的能力不同。一種真菌多糖通常只對某一種生理效應(yīng)有作用，一些真菌多糖復(fù)合使用時，呈現(xiàn)協(xié)同作用。