王澤田， 吳春榮， 齊 越， 徐 丹， 孫科遠， 唐建國

（復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷急救危重癥醫(yī)學中心，上海 200240）

白念珠菌是人類腸道的常見條件致病菌，正常情況下與宿主之間維持平衡狀態(tài)。然而，當腸道屏障受損，如休克腸道缺血、消化道穿孔、腸梗阻、腸道手術(shù)等情況下，白念珠菌可入侵腸上皮屏障，進入無菌體腔，如胸腹腔等，甚至進入血流，導致侵襲性白念珠菌感染[1-2]。臨床診斷白念珠菌感染主要依靠微生物涂片和培養(yǎng)，但周期較長，陽性率不高。因此，尋找白念珠菌感染的生物標志物是急需解決的難題。

外泌體包含許多信號分子、脂類、蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA和siRNA等，能在細胞間傳遞重要的介質(zhì)，并順利通過體液循環(huán)而不受體內(nèi)各種酶的降解[3-5]。因外泌體具有特異性生物標志物，能為白念珠菌感染提供有價值的診斷，所以筆者嘗試分析血清外泌體蛋白質(zhì)組學，尋找侵襲性白念珠菌感染的特異性標志物。

材料和方法

一、菌株和實驗動物

白念珠菌標準菌株ATCC10231、金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213和大腸埃希菌標準菌株ATCC25922購于上海魯微科技有限公司；SPF級別雄性Wistar小鼠60只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。上海交通大學生命科學院動物房飼養(yǎng)，實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)2周，其中8只用于白念珠菌感染的外泌體蛋白組學實驗，其余用于差異蛋白鑒定實驗。

二、菌液配置和模型構(gòu)造

國內(nèi)、外研究顯示，尾靜脈注射LD50菌液濃度2.5×108CFU(colony forming units)1mL建立小鼠白念珠菌侵襲感染模型。本課題組前期研究證明該濃度的有效性[6]。取8只小鼠分為白念珠菌組4只，正常對照組4只。白念珠菌組尾靜脈注射2.5×108CFU1mL的白念珠菌菌液，正常對照組注射無菌生理鹽水，注射量均為0.1 mL110 g。注射后24 h采用心臟采血法采集血液。注入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝管，4℃，1 600 r1min離心10 min。上清液分離成血清，-80℃保存。

三、分離富集血清外泌體

取出-80℃血樣品(1 mL1等份)，快速解凍，3 500 r1min離心30 min。4℃下清除細胞碎片和雜質(zhì)。每管上清液用1×PBS(中國生工生物)預冷稀釋至7 mL，用0.22 mm(美國密理博)過濾。超離心法分為萃取和洗滌兩步進行。所有的超離心法均在160 000 r1min,4℃，使用SW41轉(zhuǎn)子(Beckman Coulter,USA)進行。第一步離心后，取出上清液，用1 mL 1×PBS重懸托盤行第二步。在試管底部收集外泌體，最后用200 mL 1×PBS重懸。

四、外泌體納米粒徑分析

將富集的外泌體懸浮于100 μL PBS溶液，充分震蕩混合。將10 μL樣品，用超純水稀釋至1 mL，注入Nano-Sight S300納米粒度儀，按標準程序測定粒徑分布和濃度。每個樣本的采樣分析為3次。采用Nano-Sight NTA(V3.2)軟件分析結(jié)果，擬合3次結(jié)果。將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中。取10 μL滴在電鏡測試銅網(wǎng)上，室溫下靜置5 min，用濾紙吸去浮液，用超純水洗3次。待風干后加10 μL磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，靜置染色2 min。用無塵濾紙吸去殘液，室溫靜置風干，制成電鏡測試樣本，上機分析。采用透射電鏡(Tecnai G2 Spirit Bio TWIN，USA)80～120 kV下觀察血清外泌體的形態(tài)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢查血清外泌體的標志性蛋白質(zhì)CD63。簡要實驗步驟為：用10%分離膠和5%濃縮膠。濃縮膠用80 V、分離膠用120 V進行電泳。根據(jù)預染Marker指示，轉(zhuǎn)移相應(yīng)蛋白質(zhì)到PVDF膜。用5%脫脂牛奶封閉液封閉，室溫1 h。封閉后分別用抗 CD63抗體 1∶1 000、β-actin抗體1∶1 000 保溫過夜，TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，保溫二抗辣根過氧化物酶標志山羊抗兔IgG 1∶20 000，室溫1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。用增強化學發(fā)光曝光、顯影，用Image J軟件分析測定其灰度值。

五、蛋白質(zhì)酶解

首先，外泌體蛋白質(zhì)和50%乙醇組成有機溶液，50%丙酮和0.1%醋酸的5倍體積完全混合，與獲得的蛋白質(zhì)沉淀溶解在6 mol1L鹽酸胍溶液，-20℃過夜。加入dl-硫蘇糖 2 μL，60℃下還原60 min。然后加入10 μL吲哚-3-乙酸、烷基化液避光40 min。將得到的蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到10 kDa的濾管中，4℃，130 00 r1min，離心20 min濃縮蛋白質(zhì)。以酶∶蛋白質(zhì) 1∶20的比例加入胰蛋白酶 (美國Promega)。酶解后用C18濾芯脫鹽，冷凍干燥，加入40 μL溶解緩沖液復溶，肽段定量光密度(optical density,OD)280。

六、LC-MS1MS 數(shù)據(jù)采集

用0.1%甲酸重新懸浮干燥的肽至最終濃度為0.5 g1L，每個樣品用簡單的nano-UPLC 1000與軌道阱質(zhì)譜儀+質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific,USA)分析2 mL。肽用緩沖液B(0.1%TFA在乙腈中)梯度洗脫：0～65 min,3%～35%緩沖液 B；66～68 min,35%～80%緩沖液 B；69～75 min,80%緩沖液 B，流速300 nL1min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件以數(shù)據(jù)依賴方式獲取。全掃描MS譜質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m1z,300～1 500)，分辨率為 70 000(m1z，200)，自動增益控制(AGC)2×105，最大進樣時間 100 ms，前驅(qū)電荷2～6。從全掃描中選取前20個豐富的前體，隔離窗為2.0 m1z，在歸一化能量為35%的情況下，被更高能量的碰撞誘導離解碎片化。AGC為1×104，最大注射時間為35 ms。動態(tài)排除時間為60 s。

七、蛋白質(zhì)鑒定和定量分析

質(zhì)譜測試原始文件(Raw File)用Maxquant軟件(1.5.5.1版本)檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，最后得到蛋白質(zhì)鑒定及定量分析結(jié)果。搜索條件設(shè)置為：最多允許2個胰蛋白酶漏切位點，氧化修飾和乙?；揎椩O(shè)為可變修飾，前體和碎片離子的質(zhì)量誤差分別為6×10-6和 0.5 Da。蛋白質(zhì)鑒定的標準為：至少檢測到2個特征肽段，P＜0.05，假陽率＜1%。通過在Maxquant中使用基于強度的絕對定量(intensitybased absolute protein-quantification,iBAQ)對鑒定的肽段進行定量分析。將每種蛋白質(zhì)的iBAQ對其所在樣品總iBAQ值的貢獻進行歸一化處理，且至少根據(jù)該蛋白質(zhì)的兩個特征肽段iBAQ值來確定其相對豐度。計算差異蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)和P值，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義，變化倍數(shù)＞2為顯著上調(diào)，＜0.5為顯著下調(diào)。

八、差異蛋白鑒定

為驗證上述差異蛋白在不同病原菌感染中的表達差異，筆者取30只小鼠再次構(gòu)建白念珠菌感染模型，分別在感染12、24、36 h每組依次處死10只小鼠。取20只小鼠構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染模型和大腸埃希菌感染模型，每組10只。金黃色葡萄球菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為4.5×108CFU1mL的菌液[7]。大腸埃希菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為 2×109CFU1mL的菌液[8]，在感染12 h后處死小鼠。采用心臟采血法采集各組小鼠血液，置入EDTA抗凝管，4℃，1 600 r1min離心10 min，將上清液分離成血漿，-80℃保存。

使用ELISA法檢測血漿中差異蛋白含量。分別取上述小鼠的部分血漿加入ELSIA試劑盒中，嚴格按照ELISA試劑盒說明進行操作。各孔用酶標儀在450 nm處測定吸光度值。用標準品的濃度與吸光度值制作標準曲線。根據(jù)線性回歸方程和樣品的吸光值計算獲得對應(yīng)的濃度。樣品最終濃度=所測濃度×稀釋倍數(shù)。同時取部分血漿送至本院檢驗科，檢測白細胞、C反應(yīng)蛋白、白介素6的表達水平。

為在感染早期鑒定差異蛋白的診斷價值，在各組小鼠感染12 h后，根據(jù)差異蛋白在白念珠菌感染組、金黃色葡萄球菌感染組和大腸埃希菌感染組中的表達水平建立受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，計算曲線下面積(area under curve，AUC)及 95%CI。

結(jié) 果

一、血清外泌體的分離富集

提取白念珠菌感染的小鼠血清進行外泌體分離后，筆者觀察到小鼠血清外泌體的粒徑為100～150 nm(見圖1A)，與外泌體的形態(tài)特征一致。透射電鏡驗證獲得的外泌體，顯示出粒徑為100～150 nm的典型外泌體，具有雙層杯狀結(jié)構(gòu)(見圖1B)。用已知外泌體標記CD63的免疫印跡分析，檢測外泌體制備的效率(見圖1C)。以上結(jié)果表明，血清外泌體已成功富集，可用于實驗。

圖1 血清外泌體表征

二、差異蛋白質(zhì)篩選和聚類分析

正常對照組小鼠血清(n=4)和白念珠菌組小鼠血清(n=4)經(jīng)LC-MS技術(shù)分析，共鑒定到4 055個不同肽段，對應(yīng)到418個蛋白質(zhì)。對418個蛋白質(zhì)進行統(tǒng)計學分析，以符合白念珠菌組1正常對照組差異變化＜0.7倍至＞1.5倍，同時P＜0.05為標準，共得到差異蛋白91個(見圖2A)。根據(jù)白念珠菌組1正常對照組差異變化＜0.5倍至＞2.0倍，同時P＜0.05為標準，篩查出蛋白質(zhì)10個(見表1)。應(yīng)用Omicsbean生物信息學分析軟件對91個差異蛋白進行基因本體分析和KEGG通路分析。在生物學過程、分子功能、細胞組成方面進行基因本體分析。結(jié)果顯示，這些差異蛋白主要涉及的生物學過程包括：蛋白質(zhì)活化級聯(lián)、免疫反應(yīng)、防御應(yīng)答、補體激活、經(jīng)典激活途徑。涉及的分子功能包括：免疫球蛋白受體結(jié)合、抗原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、受體結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性。涉及的細胞組成包括細胞間隙、血液微粒、免疫球蛋白復合物、外泌體(見圖2B)。KEGG通路分析顯示，這些差異蛋白主要涉及補體系統(tǒng)、黏著斑、血小板激活、PPAR信號通路、細胞外基質(zhì)受體相互作用、吞噬體、氮素代謝、維生素的消化與吸收、集合管酸分泌、溶酶體、細胞凋亡(見圖2C)。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用及其形成的網(wǎng)絡(luò)對揭示蛋白質(zhì)的功能具有重要意義。同時，結(jié)合蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析和pathway注釋的結(jié)果，可在分子水平上獲得更全面、系統(tǒng)的細胞活性模型(見圖2D)。

圖2 外泌體蛋白生物信息分析

表1 在白念珠菌感染中變化顯著的10個候選蛋白質(zhì)

三、差異蛋白的驗證

在白念珠菌組的特異表達蛋白質(zhì)中，找出與白念珠菌密切相關(guān)的2個蛋白質(zhì)，Cathepsin B和Pentraxin 3。在白念珠菌感染 12、24、36 h后，觀察上述差異蛋白和感染標志物白細胞、C反應(yīng)蛋白和白介素6表達變化趨勢，發(fā)現(xiàn)隨著感染時間延長，差異蛋白的表達量逐漸升高，并與上述感染標志物變化一致。而且小鼠活動下降、食欲減退、尾巴潮濕等癥狀隨著感染時間延長而加重(見圖3A)。在感染12 h后采用GraphpadPrim 6.0軟件建立ROC診斷模型，比較 Cathepsin B AUC為 0.9587，95%CI為0.885～1.032，靈敏度80.0%，特異度90.0%。Pentraxin 3 的 AUC 為 0.97，95%CI為 0.907～1.033，靈敏度81.8%，特異度90.9%(見圖3B)。構(gòu)建大腸埃希菌感染的動物模型(n=10只)和金黃色葡萄球菌感染的動物模型(n=10只)。金黃色葡萄球菌感染組尾靜脈注射LD50濃度為4.5×108CFU1mL的菌液[7]。大腸埃希菌感染組尾靜脈注射LD50濃度2×109CFU1mL的菌液[8]。分別使用ELISA，驗證上述蛋白質(zhì)在白念珠菌感染組、大腸埃希菌感染組和金黃色葡萄球菌感染組的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cathepsin B、Pentraxin 3在白念珠菌感染組中大量表達，在正常對照組、金黃色葡萄球菌感染組、大腸埃希菌感染組少量表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖3 C、D)。

圖3 差異蛋白的驗證

討 論

白念珠菌是一種常見的條件致病真菌，常寄生于人體腸道黏膜表面。因腸道的物理屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障等保護作用，通常白念珠菌不引起致病[9-11]。當機體處于手術(shù)等高度應(yīng)激或腸道功能紊亂時，腸道屏障受損，白念珠菌可致病，嚴重時危及生命[12-13]。對于圍術(shù)期病人，早期診斷白念珠菌感染具有重要的臨床意義。

目前已確定具有多種亞型的多功能循環(huán)外泌體存在于多類疾病，如心血管疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病等。此外，外泌體還具有調(diào)節(jié)免疫、抗原呈遞的功能，對適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有重要的作用[14-16]。外泌體也作為一種可調(diào)控的新型藥物，用于膿毒癥的診斷和治療[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌組小鼠與正常對照組小鼠的血漿外分泌蛋白存在差異。共篩選出10個在白念珠菌組中表達顯著增加的血漿外泌體蛋白。篩選出Cathepsin B、Pentraxin 3與白念珠菌密切相關(guān)。Cathepsin B是木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，廣泛分布于各種組織細胞中，是溶酶體中重要的蛋白水解酶[19]。有研究報道，吞噬細胞外細菌導致溶酶體失穩(wěn)和Cathepsin B的釋放，調(diào)控白念珠菌誘導的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3炎癥小體激活[20]。Cathepsin B增強表達與結(jié)腸直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在腸道損傷及炎癥反應(yīng)中無研究報道，因此可進一步研究，驗證其在白念珠菌侵襲導致腸道損傷中的作用及意義[21]。Pentraxin 3是一種可溶性的體液先天免疫模式識別受體，被稱為“抗體前體”。其能識別外來微生物，并作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[22]。Pentraxin 3由血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，由中性粒細胞儲存，并在介導真菌病原體的抵抗中發(fā)揮作用，其水平可直接反映炎癥狀態(tài)。因其肝外合成，與C反應(yīng)蛋白相反；Pentraxin 3水平被認為是疾病活動性的一個真正獨立指標[23]。

為進一步驗證差異蛋白與白念珠菌感染的相關(guān)性，再次構(gòu)建白念珠菌感染的小鼠模型。通過ELISA定量分析Cathepsin B、Pentraxin3，隨著白念珠菌感染時間的延長，及炎癥介質(zhì)的進行性加重，差異蛋白的表達水平進行性升高，而且建立ROC診斷模型。實驗證明上述差異蛋白與白念珠菌感染的嚴重程度密切相關(guān)。為驗證Cathepsin B、Pentraxin3是否在其他菌株感染中表達，再次建立金黃色葡萄球菌感染和大腸埃希菌感染的小鼠模型，在感染12 h后經(jīng)小鼠眼眶取血提取血漿。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，Cathepsin B、Pentraxin 3僅在白念珠菌感染中大量表達，在正常對照組、金黃色葡萄球菌感染組和大腸埃希菌感染組中少量表達，且差異有統(tǒng)計學意義。因此，上述差異蛋白可作為白念珠菌感染的標志物。

外泌體蛋白組學在臨床研究中已廣泛應(yīng)用。有研究者發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病人血清外泌體膜蛋白GPC-1表達水平高于健康對照和乳腺良性病組，含量與腫瘤分期正相關(guān)。GPC-1陽性病人較陰性病人易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期較晚，腫瘤細胞增殖程度較高，對乳腺癌的診斷有潛在應(yīng)用價值[24]。抽提骨巨細胞瘤病人和非腫瘤病人的血清外泌體，采用LC-MS1MS分析鑒定外泌體的蛋白質(zhì)組學特征，對檢測蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，尋找骨巨細胞瘤的血漿標志物[25]。Cathepsin B、Pentraxin 3目前僅有動物實驗驗證，尚需進一步的臨床試驗，研究Cathepsin B、Pentraxin 3在白念珠菌感染中的應(yīng)用價值，為早期預防和治療白念珠菌感染提供幫助。