吳城孝， 方 婕， 周霽川， 肖永勝， 張曉光,

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院麻醉科，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院a.麻醉科，b.肝腫瘤外科，上海 200032）

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率較高，每年新增病例約36萬(wàn)例，死亡35萬(wàn)例[1]。由于癌細(xì)胞診斷晚、HCC耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等一系列問(wèn)題，目前預(yù)后仍較差[2-3]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)HCC的進(jìn)展和預(yù)后很有意義[4]。

MicroRNA參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程[5]，在許多癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起重要作用[6]。MicroRNA(miR)-324-5p參與結(jié)腸癌[7]、胰腺癌[8]、膠質(zhì)瘤[9]等多種惡性腫瘤的生物學(xué)過(guò)程。目前，miR-324-5p對(duì)HCC病人預(yù)后影響的研究證據(jù)缺乏。本研究擬通過(guò)TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析miR-324-5p表達(dá)水平與HCC病人總體預(yù)后的相關(guān)性，探討其作為HCC預(yù)后標(biāo)志物的可行性，為相關(guān)的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)來(lái)源

檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cancergenome.nih.gov)下載LIHC項(xiàng)目中的miRNAseq數(shù)據(jù)，共374例HCC組織和50例正常肝組織。50例正常肝組織包含49例為HCC組織所屬病人的正常肝組織對(duì)照，另外1例HCC病人僅有正常肝組織而無(wú)HCC組織對(duì)照。共375例病人。下載相應(yīng)臨床資料，于2021年3月下載。某些臨床參數(shù)數(shù)據(jù)缺失的病例在后續(xù)該項(xiàng)臨床參數(shù)分析時(shí)自動(dòng)剔除。根據(jù)miR-324-5p表達(dá)水平，分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，用于后續(xù)分析。

二、表達(dá)差異分析

將RPM格式的miRNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進(jìn)行樣本間表達(dá)的比較。正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-324-5p表達(dá)在兩組內(nèi)接近正態(tài)分布(P＞0.05)。方差齊性檢驗(yàn)顯示，miR-324-5p表達(dá)方差在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不相等(P＜0.05)。故選擇Welch t檢驗(yàn)分析miR-324-5p在HCC組織和正常肝組織中的表達(dá)差異。使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和多重假設(shè)檢驗(yàn)(Dunn檢驗(yàn))分析miR-324-5p在不同分期HCC組織中的表達(dá)。使用R軟件的“ggplot2”軟件包繪制差異散點(diǎn)圖。

三、預(yù)后分析

使用R軟件的 “survival”軟件包進(jìn)行生存分析，使用“survminer”軟件包繪制生存曲線(xiàn)。使用單因素和多因素Cox回歸分析臨床參數(shù)與HCC預(yù)后的關(guān)系，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio,HR)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用R軟件(3.6.3)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床特征

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-324-5p高表達(dá)組187例，低表達(dá)組病人188例。高表達(dá)組和低表達(dá)組病人的年齡、性別、腫瘤的TNM分期、病理分期、Child-Pugh分級(jí)以及肝纖維化Ishak評(píng)分[10]、血管侵犯的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高表達(dá)組甲胎蛋白＞400 μg1L病人的比例大于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 HCC病人miR-324-5p表達(dá)情況與臨床資料特征[n(%)]

二、miR-324-5p表達(dá)差異

HCC組織(n=374)中miR-324-5p表達(dá)(4.419±0.887)高于正常組織(n=50)(4.055±0.446，P＜0.001)(見(jiàn)圖1A)。不同分期HCC組織中miR-324-5p表達(dá)(Ⅰ期 4.439±0.873；Ⅱ期 4.362±0.806；Ⅲ期 4.553±0.959)均高于正常組織(P=0.014，P=0.031，P=0.009)，但不同分期HCC組織間miR-324-5p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)圖1B)。

圖1 miR-324-5p表達(dá)差異

三、miR-324-5p表達(dá)與HCC病人預(yù)后

本研究miR-324-5p高表達(dá)組病人總生存(overall survival,OS)期和疾病特異生存(disease specific survival,DSS)期均低于低表達(dá)組病人(見(jiàn)圖2)。

圖2 miR-324-5p表達(dá)與病人預(yù)后生存的關(guān)系

單因素Cox分析顯示T分期、病理分期及miR-324-5p表達(dá)與HCC病人的OS和DSS相關(guān)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示，miR-324-5p高表達(dá)是影響HCC病人OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (HR=1.537,95%CI：1.058～2.233,P=0.024)(見(jiàn)表 2)。

表2 OS的單因素和多因素Cox回歸分析

討 論

本研究探討TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC組織與肝組織中miR-324-5p表達(dá)差異，并分析其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-324-5p在HCC組織高表達(dá)。HCC病人中，miR-324-5p高表達(dá)組預(yù)后明顯差于低表達(dá)組。單因素和多因素Cox分析結(jié)果表明，miR-324-5p高表達(dá)可作為HCC病人的獨(dú)立預(yù)后影響因素。

HCC是常見(jiàn)的肝臟腫瘤，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅生命健康。因此，研究肝癌的發(fā)生機(jī)制、治療和防止復(fù)發(fā)等策略，均具有重要意義。近年來(lái)，許多研究報(bào)道了miRNA在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤生物學(xué)中的關(guān)鍵作用。

miRNA是一組進(jìn)化保守的非編碼小RNA，通過(guò)與靶信使 RNA(MRNA)的 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)堿基配對(duì)，精確調(diào)控基因表達(dá)[11]。miRNA在腫瘤的發(fā)生或發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)或抑制的作用[12]。Murakami等[13]最早研究了25對(duì)HCC和鄰近非腫瘤組織以及9例慢性肝炎的miRNA表達(dá)譜。結(jié)果表明7個(gè)成熟的miRNA和1個(gè)前體miRNA(miR-18、miR-224、miR-199a*、miR-199a、miR-195、miR-200a、miR-125a和pre miR-18)在HCC和非腫瘤組織樣本中表達(dá)差異明顯。3個(gè)miRNA(miR-92、miR-20、miR-18)和1個(gè)前體pre-miR-18與HCC的分化程度有關(guān)，提示特異性miRNA參與HCC的發(fā)展過(guò)程，可能成為有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，許多報(bào)道均表明miRNA的異位表達(dá)對(duì)HCC具有致癌或抑癌作用。這些miRNA可能是HCC治療的靶點(diǎn)[14]。

已有研究證實(shí)，miR-324-5p與多種癌癥密切相關(guān)[15]。Bamodu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)對(duì)OS的影響呈時(shí)間依賴(lài)性。高表達(dá)組5年和10年的OS率分別為52.50%和43.75%，而低miR-324-5p組5年和10年OS率分別為68.75%和36.50%。Zheng等[17]的研究還證實(shí)miR-324-5p在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，miR-324-5p的過(guò)度表達(dá)預(yù)示著胃癌病人預(yù)后不良。對(duì)HCC的研究，有報(bào)道長(zhǎng)鏈非編碼RNA的Linc01134充當(dāng)miR-324-5p分子海綿并與胰島素樣生長(zhǎng)因子2的mRNA(IGF2BP1)結(jié)合，形成的Linc011341miR-324-5p1IGF2BP11YY1反饋環(huán)路可介導(dǎo)HCC的進(jìn)展，可能成為HCC的治療靶點(diǎn)[18]。研究發(fā)現(xiàn)一種新的DE-lncRNA、RP11-85G21.1(Lnc85)，通過(guò)與miR-324-5p的靶向結(jié)合和調(diào)控，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和遷移[19]。

本研究以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，樣本量較大，臨床資料完整，為miR-324-5p在預(yù)測(cè)HCC病人預(yù)后方面的研究提供一定的參考。但血清miR-324-5p是否與腫瘤進(jìn)展水平具有相關(guān)性、miR-324-5p能否成為預(yù)測(cè)HCC病人預(yù)后的生物標(biāo)志物等問(wèn)題仍需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

綜上所述，miR-324-5p在HCC組織表達(dá)上調(diào)，與病人不良預(yù)后相關(guān)，可能是HCC預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。