袁 婷，秦利軍，趙德剛，2

（1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550006）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有的古生且分布較廣的藥用樹種和重要的膠源樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，杜仲在我國的種植面積為天然橡膠樹Hevea brasiliensis的數(shù)倍[1-3]。杜仲葉片、樹皮和翅果中均含有一種特殊物質(zhì)，外力作用下會出現(xiàn)一種白色絲狀物，該物質(zhì)即為杜仲膠（Eucommiarubber，EuR），不同組織中含膠量不同，葉片中含膠量為3%～5%，樹皮中為6%～10%，而翅果中為12%～18%[4-7]。分子結(jié)構(gòu)測定表明，杜仲膠為反式聚異戊二烯（trans-polyisoprene），與天然橡膠（Natural rubber，NR）（順式聚異戊二烯，cis-polyisoprene）互為同分異構(gòu)體[8]。兩者結(jié)構(gòu)的微觀差異引起宏觀性能的不同，杜仲膠屬于硬橡膠（Hard rubber）具橡塑二重性，而天然橡膠屬于軟橡膠（Soft rubber）具高彈性[9-11]，與三葉橡膠樹的天然橡膠相比，杜仲膠常溫下結(jié)晶，具有耐疲勞性能、粘接性能、物理機(jī)械性能等優(yōu)點(diǎn)[12]，杜仲膠的優(yōu)良特性決定了其在綠色輪胎、醫(yī)療器械和海底電纜等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用前景[13-15]。盡管杜仲樹皮中的杜仲膠含量僅次于杜仲翅果，但由于樹皮采割量有限和新皮生長周期長等缺點(diǎn)，極大限制了杜仲皮作為杜仲膠規(guī)?；崛〉脑牧?。與杜仲皮相比，杜仲翅果因收獲周期短、含膠量高及再生性能好等特點(diǎn)，可被用作杜仲膠提取的理想材料[16]。不同于天然橡膠，杜仲膠在杜仲植株中分布于特化的含膠細(xì)胞中，因?yàn)槎胖俸z細(xì)胞中杜仲膠的含量比較低并且黏度高，因此杜仲膠不能像天然橡膠一樣通過割膠直接收集，所以通常需采用物理、化學(xué)或生物等方法，如強(qiáng)酸堿或使用生物酶處理破碎植物器官和組織獲得杜仲粗膠后，才能實(shí)現(xiàn)杜仲膠的有效提取和分離[12,15,17-21]。這些方法中大多以強(qiáng)機(jī)械力、強(qiáng)化學(xué)作用等引起植物組織破裂，從而分離出杜仲膠，而這樣的處理也勢必會引起杜仲膠分子結(jié)構(gòu)和聚合度的改變，從而改變杜仲膠的性能[22]。

本研究采用堿浸提法、苯-CH3OH 法和酶水解法對杜仲翅果皮中杜仲膠進(jìn)行提取，分析不同提取方法對杜仲精膠提取率的影響；同時，對不同方法提取的杜仲膠的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，探討3 種提取法對膠性能的影響，以期為優(yōu)化杜仲膠的提取工藝、實(shí)現(xiàn)杜仲膠的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

杜仲翅果為2019年7月采自貴州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場杜仲資源圃中樹齡為15 a 的新鮮翅果。收集的翅果置于烘箱中，經(jīng)120℃殺青30 min 后90℃下烘干至恒質(zhì)量，依次經(jīng)去種留殼、粉碎、過篩（100目）處理得到翅果皮干粉樣備用。氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉均購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚、苯、甲醇、乙醚和無水乙醇均購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；纖維素酶購于和氏璧生物科技有限公司。

索氏提取器，SC 100 恒溫金屬水浴鍋（Thermo），SXKW 數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），TP-213 電子天平（北京丹佛儀器有限公司），DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱等儀器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)E 20/EL 20 pH 計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），92/262 系列（Haier 醫(yī)用低溫保存箱），F(xiàn)Z 102 微型植物粉碎機(jī)（上海諾萱科學(xué)有限公司），STA 449F3 同步熱分析儀（德國布魯克公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿浸提法

參照歐陽輝等[23]、吳可心等[24]和龔兆全等[25]的方法略做改動，準(zhǔn)確稱量杜仲果皮干粉8.00 g，加入100 mL 10%的NaOH 溶液，90℃下對杜仲果皮進(jìn)行預(yù)處理3 h 后過濾，濾渣用蒸餾水沖洗至pH 為7.0，然后置于50℃烘箱中烘至恒質(zhì)量得杜仲粗膠。以石油醚作為溶劑在90℃下回流提取26 h，將提取液置于-20℃低溫冷凍3 h，待杜仲膠析出后除去（自然揮發(fā)）或回收石油醚（離心收集），將提取的杜仲精膠置于37℃烘箱中烘干。每組設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.2 苯-CH3OH 提取法

參照陸志科等[17]的方法略做改動，準(zhǔn)確稱量杜仲果皮干粉8.00 g，置于索氏提取器中用苯進(jìn)行浸提26 h，提取液中加入1.5 倍量的CH3OH 沉淀2 h，棄去沉淀液、干燥沉淀物即得杜仲粗膠，再用乙醚溶解，所得白色沉淀物置于37℃烘箱中烘干即為杜仲精膠。每組設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.3 酶水解提取法

參照張學(xué)俊等[26]和賀揚(yáng)潔等[27]的方法略做改動，準(zhǔn)確稱量杜仲果皮干粉8.00 g。加入濃度為5%的NaOH 溶液100 mL，于37℃水浴中對杜仲果皮進(jìn)行預(yù)處理6 h 后過濾，將濾渣用蒸餾水沖洗至pH 為7.0 后，置于50℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量得杜仲粗膠，加入100 mL 預(yù)配置的0.1 g/L 纖維素酶溶液（pH 4.0），放入45℃恒溫箱中處理27 h，取出、過濾、烘干后用石油醚作為溶劑在90℃下回流提取26 h，將提取液置于-20℃低溫冷凍3 h后析出白色沉淀，棄去石油醚，將白色沉淀置于37℃烘箱中烘干，烘干物即為杜仲精膠。每組設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 杜仲膠產(chǎn)率

粗膠產(chǎn)率=預(yù)處理所得杜仲膠干質(zhì)量/樣品總干質(zhì)量×100%；

精膠產(chǎn)率=精提所得杜仲膠干質(zhì)量/樣品總干質(zhì)量×100%。

1.2.5 杜仲膠熱穩(wěn)定性測定

參照Sarina 等[28]、弓銘等[29]和牟悅興等[30]略做修改，準(zhǔn)確稱取10 mg 以3 種方法提取的杜仲精膠，樣品經(jīng)室溫至700℃變溫?zé)岱纸夂螅肧TA449F3 對杜仲膠的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析。升溫速率為10℃/min，以N2作為保護(hù)氣體。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 軟件對杜仲膠提取率進(jìn)行單因素方差分析，用LSD 法及Duncan 法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取法對杜仲膠形態(tài)的影響

不同提取方法所得杜仲膠形態(tài)上存在一定差異。堿浸提法所得杜仲膠整體色澤偏淺黃色，形態(tài)結(jié)構(gòu)致密、呈薄塊（片）狀，膠塊延展性一般（圖1A）；苯-CH3OH 法所得杜仲膠整體顏色偏暗綠色，形態(tài)結(jié)構(gòu)松散，呈凝集的團(tuán)狀，膠塊較松軟且有一定較粘稠性（圖1B）；而酶水解法提取的杜仲膠，整體色澤偏蠟黃色，結(jié)構(gòu)緊湊致密、呈厚塊（片）狀，膠塊的延展性較好（圖1C）。

2.2 不同提取法對杜仲粗膠得率的影響

苯-CH3OH 法通過將杜仲膠及非極性物質(zhì)溶解于苯中溶解粗膠，而堿浸提法和酶水解法主要通過堿液去除角質(zhì)及極性物質(zhì)獲得粗膠。因此，不同提取方法所得杜仲粗膠得率有一定差異。酶水解法、堿浸提法和苯-CH3OH 法的提取的杜仲粗膠產(chǎn)率分別為56.33%、33.29%和9.94%，說明以酶水解法處理所得粗膠中雜質(zhì)含量較高，而苯-CH3OH 法所得粗膠雜質(zhì)最低。

2.3 不同提取方法對杜仲精膠得率的影響

3 種提取法對杜仲精膠得率有一定影響。其中，酶水解法的提取率最高，為5.36%，苯-CH3OH法次之，為4.56%，以堿浸提法的提取率最低，僅為1.85%。另外，酶解法提取后所剩的植物殘渣結(jié)構(gòu)松散、無粘稠狀，也暗示該方法能有效地將植物細(xì)胞壁降解，更好地釋放細(xì)胞內(nèi)中橡膠分子。

表2 不同提取方法對杜仲精膠產(chǎn)率的影響Table 2 Effects of different extraction methods on the yield of extracted Eucommia rubber (Mean ± SE)

2.4 不同溫度處理對杜仲膠熱力學(xué)性能的影響

差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）和熱重法（Thermogravimetry，TG）曲線分析杜仲膠熱力學(xué)性能表明，發(fā)現(xiàn)3 種方法提取的杜仲膠在質(zhì)量損失5%、30%和50%時的溫度（分別記為T5%、T30%和T50%）有一定差異，但不顯著（表3）。在溫度小于300℃的低溫區(qū)，杜仲膠質(zhì)量損失微小，推測這主要是由于杜仲膠樣品吸附的水分的解吸附造成的；杜仲膠質(zhì)量損失主要發(fā)生在300～470℃范圍內(nèi)（圖2），在此溫度范圍內(nèi)苯-CH3OH 法所提取的杜仲膠質(zhì)量損失占總損失的95.05%，而堿浸提法和酶解法所得杜仲膠質(zhì)量損失分別占總損失的97.33%和97.90%。說明杜仲膠在300～470℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定較差，相比較3 種方法，苯-CH3OH 法提取的杜仲膠損失率較其它兩種方法略低。另外，盡管在杜仲膠分解率為5%時，苯-CH3OH 法所得的杜仲膠的熱分解溫度較堿提法和酶解法的低，但在其分解率為30%和50%時，熱分解溫度都比后兩者高。綜上，3 種提取法所得杜仲膠的熱穩(wěn)定性能差異不顯著。通過研究堿浸提、苯-CH3OH 法和酶水解法3 種方法提取杜仲膠的結(jié)晶吸熱曲線（圖3）發(fā)現(xiàn)杜仲膠的吸熱熔融峰只由一個峰型組成，表明用這3 種方法提取的杜仲膠只由1 種結(jié)晶晶型組成，推測為α晶型，且3 種方法所得杜仲膠該晶型的熔點(diǎn)分別為70.99℃、67.40℃和69.39℃。通過對比DSC 的吸熱光譜圖發(fā)現(xiàn)，酶水解法所提取的杜仲膠的結(jié)晶熱焓比另外2 種方法提取的略高。

表3 不同熱失重率時杜仲膠的熱分解溫度Table 3 Decomposition temperature of Eucommia rubber at different thermo-gravimetric rates ℃

圖2 不同提取所得杜仲膠TG 曲線分析Fig.2 TG curve of Eucommia rubber with different extraction methods

圖3 不同提取所得杜仲膠DSC 曲線分析Fig.3 DSC curve of Eucommia rubber with different extraction methods

3 結(jié)論與討論

杜仲E.ulmoidesOliv.為杜仲科Eucommiaceae杜仲屬Eucommia雌雄異株的多年生落葉喬木[31]，杜仲葉片、果皮、樹皮及根皮中均含杜仲膠，杜仲膠又稱古塔波膠（gutta-percha），是杜仲次生代謝合成的一種重要天然高分子化合物[32]，具有較為廣泛的應(yīng)用價值。本研究以3 種不同方法對杜仲翅果皮中杜仲膠進(jìn)行提取，其得率存在一定差異。堿浸提法和酶水解法均采用NaOH 進(jìn)行前期處理獲得杜仲粗膠，比較杜仲粗膠得率發(fā)現(xiàn)，以NaOH 預(yù)處理杜仲翅果皮樣品最佳的提取條件為10% NaOH 溶液90℃處理3 h，粗膠得率為33.29%，說明在該條件下大量的極性可溶物質(zhì)被強(qiáng)堿所分解，而保留了杜仲膠等非極性物質(zhì)，該結(jié)果與陸志科等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此推測，隨著溫度和堿液濃度的升高，纖維素、木質(zhì)素分解速度加快，樹脂成分的皂化速度也加快，即升高溫度和堿液濃度有利于翅果殼中的非膠成分分解。另外，3 種提取法中以酶水解法所得粗膠產(chǎn)率和精膠產(chǎn)率都最高，分別為56.33%和5.36%，表明低濃度堿處理結(jié)合溫和的酶處理不僅能保留大量的膠組分和雜質(zhì)組分（杜仲粗膠），還能使雜質(zhì)組分在后續(xù)提膠過程中迅速去除，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)杜仲精膠的高提取率。盡管酶解法所得杜仲精膠得率較高，但與歐陽輝等[23]以相同方法提取杜仲翅果皮中杜仲膠相比，提取率有一定程度下降，推測造成此現(xiàn)象的原因可能是選用的翅果齡期不同導(dǎo)致的差異，一方面不同月份翅果中膠含量有一定差異[33]，另一方面本實(shí)驗(yàn)采用的翅果皮干樣過篩（100 目）后引起了杜仲膠組分的喪失，進(jìn)而導(dǎo)致較低的杜仲膠提取率。

杜仲膠具有優(yōu)良的耐熱性，為了研究這3 種提取法對杜仲膠耐熱性能的影響，對杜仲膠熱力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，苯-CH3OH 法所提取的杜仲膠在T30%和T50%熱分解溫度比其余2 種方法所提杜仲膠略高，但差異不顯著；另外，一般認(rèn)為杜仲膠至少存在兩種確定的晶型，即α 晶型和β 晶型，前者適于在高溫形成，后者則適于在低溫下形成。通過對比張?zhí)祧蝃34]和劉奇等[13]的研究結(jié)果，本研究中3 種方法所得杜仲膠的DSC 曲線只含有一個吸熱熔融峰，熔解溫度在70℃左右，暗示這些方法所得杜仲膠均為高溫形成晶型，即α 晶型。推測造成此現(xiàn)象的原因可能是杜仲植株間品種或提取方法本身的差異導(dǎo)致了杜仲膠的晶型種類和熔解溫度的不同。通過對比DSC 曲線的吸熱光譜圖發(fā)現(xiàn)，酶水解法所提取的杜仲膠的結(jié)晶熱焓比另外2 種方法提取的略高，說明該法所提取的杜仲膠分子結(jié)構(gòu)相似度更高、結(jié)晶度更好。因此，在杜仲膠提取的實(shí)際生產(chǎn)中可考慮使用苯-CH3OH法和酶水解法。2 種方法相比較，后者不僅可滿足杜仲膠得率高、雜質(zhì)少且所得杜仲膠分子結(jié)構(gòu)一致、結(jié)晶度高，而且所使用的試劑溫和對植物材料破壞小且對人體危害小。

本研究采用不同提取方法對杜仲翅果皮中的杜仲膠進(jìn)行提取，其中以酶水解法提取杜仲膠得率最高。進(jìn)一步通過對所提取的杜仲膠進(jìn)行性能分析，3 種方法提取所得杜仲膠的耐酸堿性和熱穩(wěn)定性均無顯著差異，但對杜仲膠的結(jié)晶度有一定影響，以酶水解法提取的杜仲膠得率較高且結(jié)晶度也最好。目前，本研究僅在實(shí)驗(yàn)室開展杜仲膠提取比較實(shí)驗(yàn)，因此如果將該法用于杜仲膠規(guī)?；崛?，還需進(jìn)一步摸索酶解提取法的提取工藝參數(shù)，以為實(shí)現(xiàn)杜仲膠的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。