王麗霞，王運(yùn)昌，李榮榮，張潔莉，安 靜，李妤蓉*

(1.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺 054001；2.河北省邢臺市眼科醫(yī)院眼特檢科，河北 邢臺 054001；3.河北省邢臺市眼科醫(yī)院青光眼科，河北 邢臺 054001)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)為一種機(jī)會致病菌，是醫(yī)院感染和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎中最常見的細(xì)菌[1-2]。近些年由于廣譜抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致獲得性耐藥、適應(yīng)性耐藥和多重耐藥菌株頻頻出現(xiàn)，使得臨床用藥的選擇受到限制。而重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)具有環(huán)境相對封閉、患者病情嚴(yán)重和侵入性操作較多等特點(diǎn)，PA感染和耐藥的情況更為突出[3]。但研究顯示不同地區(qū)的ICU病房流行的耐藥菌株存在差異，即使相同的菌株在不同的ICU病房之間，其耐藥率也存在明顯差異[4]。分析本院ICU中PA 的耐藥情況和耐藥基因型的分布對臨床治療有重要的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1菌株的來源 本研究的菌株選在2019年1月—2020年1月在邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院ICU患者送檢的臨床標(biāo)本中分離的PA，經(jīng)過鑒定納入本研究來自不同患者的42株菌株，接種至含有磁珠的菌種保存管中，放置-80 ℃冰箱中待用。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 選用臨床上常用的12種抗菌藥，氨基糖苷類(慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星)，氯喹諾酮類(左氧氟沙星和環(huán)丙沙星)，碳青霉烯類(美羅培南和亞胺培南)，青霉素類(哌拉西林)，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物(頭孢吡肟和頭孢他啶)，單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(氨曲南)和多肽類(多黏菌素B)。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922和大腸埃希菌ATCC35218(用于β-內(nèi)酰胺或β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物)。參照2018年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的藥敏實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。采用自動化儀器法和紙片擴(kuò)散法，紙片擴(kuò)散法僅作為自動化儀器法的補(bǔ)充。制備瓊脂培養(yǎng)基，傾注至平板中，厚度為5～6 mm。取一菌株，均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌的鑷子將待測抗菌藥物藥片(不同藥物濃度)貼在對應(yīng)的平板內(nèi)，呈圓形均勻的分開，每個平板貼4～6個抗菌藥片，并輕輕按壓以免脫落。 在37 ℃培養(yǎng)箱中放置18 h，記錄最小的抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和抑菌圈直徑。

1.3抗菌藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn) 敏感性藥敏結(jié)果判斷依據(jù)2018年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4DNA樣本提出 凍存菌株放置室溫下自然解凍，挑取一環(huán)菌株接種至普通營養(yǎng)瓊脂上，放置培養(yǎng)箱中過夜，挑取菌落至無菌肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的細(xì)菌于離心管中，4 000 r/min，離心10 min。棄去上清，加入500 μL蒸餾水，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，放于100 ℃水浴中10 min，然后12 000 r/min離心10 min，將上清保留至-20 ℃冰箱中用于PCR擴(kuò)增。

1.5PCR基因擴(kuò)增 總反應(yīng)體系為25 μL，具體擴(kuò)增體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，細(xì)菌 DNA 模板1 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物(10 μmol/L) 1 μL，引物序列見表1。無核酸水ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min，35個循環(huán)，變性94 ℃ 1 min，退火50～65 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min，最終延伸72 ℃ 10 min，短暫存放于4 ℃冰箱中用于瓊脂凝膠電泳。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6瓊脂糖凝膠電泳 稱取0.2 g瓊脂糖干粉，倒入含有18 mL電泳緩沖液的三角燒瓶中，放置微波爐中，加熱成透明的液體，冷卻至65 ℃時(shí)，加入0.2 μL的核酸染液，傾注至凝膠制作槽中，插入制膠梳，待瓊脂糖凝膠凝固，加入電泳緩沖液。拔出梳子，加入樣本，電泳1～3 h。將凝膠取出，放在含有溴化乙錠的液體中染色30 min，在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.1統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)(Fisher確切概率法)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PA的檢出情況 送檢樣本共分離出PA菌株65株，成功鑒定出46株P(guān)A，排除外周血中和膿液中PA菌株，最終納入本研究的自下呼吸道的痰液標(biāo)本中分離出的42株P(guān)A，見表2。

2.2PA對臨床上常用藥物的耐藥結(jié)果 PA對臨床上常用藥物的耐藥結(jié)果如表2所示，除阿米卡星、妥布霉素、亞胺培南和多黏菌素B外，其余藥物的耐藥率均在30.0%以上，另外環(huán)丙沙星、美羅培南和氨曲南的耐藥率達(dá)40.0%以上，對多黏菌素B的耐藥率為0，敏感率為100%。氨基糖苷類、氯喹諾酮類、碳青霉烯類和頭孢菌素組內(nèi)藥物耐藥情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 PA檢測的標(biāo)本類型Table 2 Types of specimens of PA tested

表3 PA對臨床上常用藥物的耐藥情況Table 3 The resistance of PA to commonly used drugs in clinical practice (n=42，例數(shù)，%)

2.3PA的耐藥基因和Ⅰ類整合子檢測 PA耐藥基因檢測結(jié)果顯示，超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因blaPER 基因和blaTEM-1基因未檢測到，blaCTX-M-1基因陽性的有3例，攜帶率為7.1%。碳青霉烯類相關(guān)耐藥基因中未檢測到blaGES 基因，blaIMP基因陽性者8例，攜帶率為19.0%，blaOXA-1基因陽性者7例，攜帶率為16.7%。氨基糖苷類相關(guān)耐藥基因中未檢測到aac(3)-Ⅱa基因，aac(6′)-Ⅰb基因陽性患者10例，攜帶率為23.8%，ant(2″)-Ⅰa基因性患者8例，攜帶率為19.0%。外排泵基因OprD2缺失患者8例，缺失率為19.0%。Int-Ⅰ攜帶者10例，攜帶率為23.8%。

3 討 論

近些年隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用和重癥患者的有創(chuàng)醫(yī)療手段的應(yīng)用，使得細(xì)菌感染類型和耐藥性有所改變，院內(nèi)感染率增加，耐藥菌大多為條件致病菌[5]。PA是臨床上常見的一種條件致病菌，在2015年發(fā)布的臨床數(shù)據(jù)中顯示，PA位于不發(fā)酵糖革蘭陰性菌分離率的前三位[6]。ICU大多為復(fù)雜大手術(shù)后患者、呼吸衰竭患者、心功能不全的患者等，部分需要呼吸輔助或有創(chuàng)的輔助治療，增加了PA的感染率。在抗菌藥物使用的過程中，PA可激活耐藥基因或突變產(chǎn)生耐藥基因使其快速適應(yīng)抗菌環(huán)境，表現(xiàn)出不同的耐藥機(jī)制[7-8]。因此了解本院ICU病房PA耐藥現(xiàn)狀和主要的耐藥基因型對臨床指導(dǎo)抗菌藥物使用和降低耐藥發(fā)生率有重要的臨床價(jià)值。本研究共納入2019年度ICU病房痰液標(biāo)本中分離出的PA菌株42株，分離PA的標(biāo)本主要來源于下呼吸道，與解澤強(qiáng)等[9]研究結(jié)果相一致。本研究中分離的PA菌株對抗菌藥物的敏感性測試顯示，對氨曲南(42.9%)、環(huán)丙沙星(40.5%)、美羅培南(40.5%)耐藥率較高，均在40.0%以上。本研究中PA對頭孢他啶的耐藥率為38.1%，明顯高于Pang等[7]研究結(jié)果顯示的頭孢他啶的耐藥率在7.80%，另外PA對慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐藥率在本研究中雖處于較低水平，但與胡付品等[6]研究的相比仍較高，因此頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星的臨床使用應(yīng)嚴(yán)格按照指南進(jìn)行。PA對氨曲南、環(huán)丙沙星、美羅培南對的耐藥率較高，在經(jīng)驗(yàn)性治療中應(yīng)引起注意。阿米卡星和多黏菌素B對PA具有較好的抗菌活性，尤其是多黏菌素 B，就本研究結(jié)果而言，阿米卡星可作為重度PA感染的首選藥物，而多黏菌素B則作為治療PA的最后一道防線。

本研究對耐藥基因型進(jìn)行分析，超廣譜β-內(nèi)酰胺相關(guān)耐藥基因中，并未檢測blaPER、blaTEM-1基因，而blaCTX-M-1基因陽性率為7.1%，不同的PA可能產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺相關(guān)耐藥基因不同，而同一菌株也可能攜帶不同的耐藥基因型。張雪青等[10]研究顯示，浙江地區(qū)某院內(nèi)分離菌株產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺相關(guān)耐藥基因型主要為blaTEM 型。侯天文等[11]在河北地區(qū)及向波等[12]在廣州地區(qū)的研究顯示PA菌株中產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺相關(guān)耐藥基因型主要為blaPER型，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果均不一致，可能與耐藥基因型的產(chǎn)生有明顯的地域特點(diǎn)。碳青霉烯酶耐藥基因檢測中，42例菌株中共檢測到15例碳青霉烯酶耐藥基因陽性，blaIMP基因陽性率為19.0%(8例)、blaOXA-1基因陽性率為16.7%(7例)。在氨基糖苷類相關(guān)耐藥基因型檢測中aac(6′)-Ⅰb、ant(2″)-Ⅰa和aac(3)-Ⅱa基因的攜帶率依次為23.8%、19.0%和2.4%，aac(6′)-Ⅰb基因型的檢出率最高。OprD2蛋白是抗菌藥物亞胺培南進(jìn)入PA體內(nèi)的特異性通道，可與亞胺培南特異性結(jié)合，與其他β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物不存在交叉耐藥性，有較強(qiáng)的配體特異性[13-14]。本研究中有11例PA對亞胺培南耐藥，OprD2蛋白缺失的為8例，另外還有3例對亞胺培南耐藥的PA菌株未檢測到OprD2蛋白缺失，也可能是由其他的耐藥機(jī)制。多麗波等[15]研究顯示，廣西地區(qū)的PA外膜蛋白基因的缺失率79.30%，而本研究中OprD2蛋白缺失率僅為19.0%，有明顯的差異，可能與收集樣本差異、臨床經(jīng)驗(yàn)用藥的習(xí)慣不同或地區(qū)性差異有關(guān)。整合子是可在同種或一種細(xì)菌之間進(jìn)行傳遞的可移動遺傳元件，其本身攜帶多種耐藥基因還可通過獲取的方式獲得耐藥基因[16]。blaIMP與blaOXA-1、ant(2″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb 均為Ⅰ類整合子中攜帶的耐藥基因盒，在本研究中的檢出率為23.8%(10例)，與劉珺[17]的研究結(jié)果28.57%相近，提示整合子是PA耐藥性傳播的一個主要原因之一，因此在臨床上需要及時(shí)的監(jiān)測，以免造成菌株間耐藥性傳播，給PA的臨床治療帶來麻煩[18]。

綜上所述，本研究對ICU病房分離的PA菌株進(jìn)行檢測，通過分析PA耐藥和耐藥基因型特點(diǎn)，以期為臨床治療提供幫助；同時(shí)應(yīng)提高對PA耐藥性的重視，加強(qiáng)臨床監(jiān)測、控制院內(nèi)感染降低PA的感染率和耐藥率。