劉彥權(綜述)，陳亞春，沈建箴(審校)

(1.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院科研中心，江西 贛州 341000；2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所，福建 福州 350001)

眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個漫長且多階段的復雜過程，其間伴隨了眾多的分子事件。通常，在DNA復制與修復過程中，會產生一種含有5′分支結構的特殊DNA中間體，即5′-Flap，對于DNA復制與修復、基因組完整性和穩(wěn)定性的維持等而言，此類Flap結構的切除顯得尤為必要[1]，而Flap核酸內切酶1(flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1)是識別這種特殊結構的關鍵酶。近年來，諸多研究證實FEN1參與多種疾病，尤其是對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤生物學行為等密切相關?，F(xiàn)就國內外有關FEN1與腫瘤相關性研究最新進展予以論述，為相關領域科研工作提供借鑒與參考。

1 FEN1的分子結構

FEN1是一種兼?zhèn)?′→3′Flap核酸內切酶(flap endonuclease，F(xiàn)EN)、內切核酸酶(gap-dependent endonuclease，GEN)以及外切核酸酶(exonuclease，EXO)三大酶切活性的特異性結構的核酸酶，作為Rad2核酸酶家族原型成員的FEN1，其定位在人類染色體11q12上，含有2個外顯子、1個內含子[2]。FEN1的外顯子l很短，只編碼mRNA部分的5′-UTR區(qū)；但FEN1的外顯子2卻較長，編碼全部的氨基酸編碼區(qū)、3′-UTR區(qū)以及部分5′-UTR區(qū)。人FEN1蛋白包含由螺旋門、疏水楔形區(qū)域、活性中心、帽子結構、β-pin、H2TH以及酸性阻滯等構成，其可通過鹽橋或“電荷-電荷”等相互作用與底物DNA結合，螺旋門、疏水楔形區(qū)域、帽子結構以及H2TH共同參與并構成FEN1蛋白活性中心，其中5′-flap DNA在穿過螺旋門后被切割[3]。

2 FEN1的功能

2.1參與岡崎片段成熟 DNA復制過程中，通常會產生一條正向連續(xù)的前導鏈與一條反向非連續(xù)的滯后鏈，而滯后鏈合成中，產生一系列短的岡崎片段。岡崎片段的成熟，對于DNA復制、細胞增殖等尤為關鍵。通常，DNA的復制過程先是由DNA pol α/引發(fā)酶復合體合成長約為12 nt的RNA引物，之后再繼續(xù)合成長約為20 nt的DNA。由于DNA pol α缺乏3′核酸酶的校正功能，導致起始引物的保真度一般較低。此外，DNA polε、DNA polδ分別負責了前導鏈、滯后鏈的合成[4]，通過依賴ATP復制因子C(repication factor C，RFC)加以協(xié)調聚合酶的轉換，RFC作為加載器將增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、DNA polε或DNA polδ加載到復制位點。當在下游遇到岡崎片段時，DNA polδ形成一個5′-flap，F(xiàn)EN1識別并與該結構底部結合，并通過精確切割、產生一個切口，后借助DNA連接酶Ⅰ(DNA LigaseⅠ)連接該切口，進而完成岡崎片段成熟[5]。

2.2參與DNA損傷修復 由于其持續(xù)暴露在各種內、外源因素中，DNA損傷無時無刻都在發(fā)生，DNA損傷若無法在第一時間得到修復，將導致基因突變、基因組不穩(wěn)定性的發(fā)生，進而引起機體細胞惡性轉化[6]。人類DNA在面對各類損傷因素，其自身具備一套較為完善的修復途徑，包括堿基切除修復(base-excision repair，BER)、錯配修復(mis-match repair，MMR)、核苷酸切除(nucleotide excision repair，NER)、同源重組(homologous recombination，HR)、SOS應激等修復，而FEN1參與了上述多種DNA修復途徑。一般而言，堿基的單個損傷僅需DNA的BER途徑即可完成，依據(jù)BER延伸片段的不同長度，可區(qū)分成長片段BER(long-patch base excision repair，LP-BER)與短片段BER(short-patchbase excision repair，SP-BER)[7]。在LP-BER中，DNA polβ以切口上游3′-OH引物為延伸，將下游的5′-DNA 鏈予以置換，形成5′-flap結構，由FEN1切除，而切除后殘留的切口則由DNA LigaseⅠ連接[8]，人體修復體系中若缺少FEN1，LP-BER將難以完成。此外，在人細胞的線粒體中，對于2-DL(某無堿基氧化位點)損傷修復有賴于FEN1的LP-BER途徑完成的，證明FEN1在氧化損傷修復過程中同樣起到重要作用[9]。

2.3端粒穩(wěn)定性維持與細胞凋亡DNA片段化 相關學者研究表明，通過分析敲除FEN1后人類腫瘤細胞的端粒，發(fā)現(xiàn)FEN1在維持端粒穩(wěn)定性中不可缺少[10]。與此同時，F(xiàn)EN活性作為FEN1最經典的活力之一，但對其另外EXO和GEN活性而言，對其他生物學功能或代謝途徑同樣重要，如凋亡細胞DNA片段處理等。FEN1通過促使端粒融合失調、染色體“breakage-fusion-bridge”周期等，影響端粒穩(wěn)定性與基因組保真度，F(xiàn)EN1亦能與端粒酶形成復合體，調控其端粒酶活性，并促進與端粒染色質的結合。同樣，F(xiàn)EN1參與凋亡細胞DNA片段化：通過RNA干擾技術下調FEN1同源基因CRN1蛋白的活性，可導致細胞死亡。此外，E160D作為FEN1點突變體，由于EXO、GEN活性的缺失，阻礙了FEN1對凋亡細胞DNA的處理。為此，F(xiàn)EN1若出現(xiàn)調控異?；蚬δ苋笔r，將引起端粒與基因組的穩(wěn)定性的破壞，進而誘導正常細胞惡性轉化為腫瘤細胞。

3 FEN1在腫瘤中的作用與機制

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可視作生物體進化過程里的一段縮影，從正常細胞到腫瘤惡性細胞的演化進程中，基因突變、染色體異常、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等因素不斷增加，促使腫瘤不斷生長，并在雜交腫瘤細胞群體中連續(xù)性累積，從而進一步加重基因的損傷與基因組不穩(wěn)定性。如前已述，F(xiàn)EN1在細胞內的各種DNA代謝途徑中發(fā)揮至關重要的作用，為此，F(xiàn)EN1在細胞代謝與生化過程必須得到十分精細嚴格的調控，若在任一環(huán)節(jié)中出現(xiàn)異常狀態(tài)或功能失調，將對細胞甚至機體產生不可逆的惡性損害。

3.1FEN1與惡性腫瘤的臨床關聯(lián)性 Ren等[11]的一項薈萃分析證實，F(xiàn)EN1作為一種多功能因子，其突變會導致基因組不穩(wěn)定和癌癥易感性，到目前為止已鑒定出超過30種與FEN1相互作用的蛋白，但除了凋亡DNA片段化途徑外，在這些FEN1相互作用的蛋白中，最初被鑒定為復制輔助蛋白的PCNA與FEN1一起參與了所有FEN1涉及的DNA代謝途徑，表明FEN1 / PCNA相互作用調節(jié)LP-BER，且該學者所在的團隊已證實FEN1的抑癌功能，表明FEN1是維持基因組穩(wěn)定性和防止癌變的關鍵因素。與此同時，F(xiàn)EN1的純合子敲除對于轉基因小鼠胚胎是致死性的，盡管部分的FEN1雜合子敲除鼠能夠存活，但其本身極易誘發(fā)惡性腫瘤疾病，表明FEN1是一個抑癌基因[12]。同樣，有學者研究證實FEN1是兒童急性淋巴細胞白血病的保護性因素，且是與預后相關聯(lián)的分子標記物[13]。

然而，Zhao等[14]研究顯示，F(xiàn)EN1在胃癌組織中的表達水平高于正常胃組織，且FEN1的高表達與年齡相關(P<0.05)，F(xiàn)EN1過表達的患者與低FEN1表達的患者相比有良好的預后，此外，F(xiàn)EN1的表達與DNA復制、細胞周期、胞質傳感途徑、卵母細胞減數(shù)分裂以及P53信號通路密切相關，是胃癌診斷和預后生物標志物。

雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)是大多數(shù)乳腺癌中的關鍵轉錄調節(jié)因子，ERα陽性的乳腺癌患者在接受他莫昔芬治療時發(fā)生耐藥很常見。近期，F(xiàn)lach等[15]研究表明，F(xiàn)EN1通過促進共激活因子募集到ERα轉錄復合體影響ERα的轉錄活性，F(xiàn)EN1通過阻斷誘導蛋白酶體介導的活化ERα降解，進而導致ERα驅動基因表決表達，并促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。與此同時，F(xiàn)EN1抑制劑可有效阻斷ERα功能并抑制他莫昔芬耐藥細胞系以及離體培養(yǎng)的ERα陽性乳腺腫瘤的增殖。Li等[16]研究證實，F(xiàn)EN1抑制劑SC13在體內、外均可增加宮頸癌細胞對放射治療敏感，促使腫瘤細胞DNA損傷修復機制受損，進而誘發(fā)癌細胞凋亡。此外，有學者通過生物信息學技術分析了肝癌組織中表達異常的9個核心基因，研究顯示在肝癌組織中FEN1的表達與其中的MCM2、RFC4以及RFC4三個核心基因的表達呈正相關，尤其值得注意的是，F(xiàn)EN1表達水平也與肝癌腫瘤體積、血管浸潤以及遠處轉移等同樣呈正相關，表明FEN1異常升高可能是肝癌診療、預后評估的潛在生物標志物[17]。Becker等[18]學者通過構建FEN1同源物模型RAD27，顯示FEN1的過表達會阻礙復制叉的進行，使細胞停滯于S期中期，并伴隨著檢查點激酶Rad53和組蛋白H2A-S129的磷酸化增加，更重要的是，在多種人類腫瘤細胞中均可發(fā)現(xiàn)FEN1過表達，可導致CHK1、CHK2、RPA32和組蛋白H2AX的磷酸化，使基因組不穩(wěn)定，是預后不良的標志。Zhang等[19]通過實時定量聚合酶鏈反應和免疫組織化學分析技術研究了FEN1在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中的表達及其臨床意義，研究證實FEN1在136個癌組織中約有36%高度過表達，而癌旁組織通常無法檢測到FEN1，其研究進一步證實FEN1過表達的腫瘤傾向分化不良和預后不良，表明過表達FEN1是治療NSCLC的預后生物標志物和潛在治療靶點。由此可見，F(xiàn)EN1在監(jiān)護并維持基因組完整性、避免因失調或發(fā)生突變導致腫瘤的發(fā)生有著重要的調控作用。

3.2FEN1在腫瘤中的作用機制

3.2.1細胞定位區(qū)室化 FEN1的C端，包含2個核定位序列，將FEN1引導進入細胞核內，且在核仁中大量聚積，F(xiàn)EN1只有分布在細胞核內才能發(fā)揮功能，在一定程度上規(guī)避了FEN1所致基因組錯誤剪切的發(fā)生。此外，F(xiàn)EN1在核仁中聚集，參與到停滯DNA復制叉分解、核糖體DNA穩(wěn)定性的維持[20]。當發(fā)生核內DNA損傷或處于細胞周期S期時，F(xiàn)EN1將從核仁釋放，在磷酸化驅動模式下，轉移到損傷位點進行修復。在紫外損傷處理后，F(xiàn)EN1發(fā)生磷酸化，從核仁轉移至核漿，并依靠EXO、GEN活性參與DNA UV交聯(lián)的修復，說明FEN1的核定位，是受到DNA損傷、細胞周期所調節(jié)的。盡管FEN1主要定位于細胞核，但活性氧卻在線粒體產生，當線粒體mtDNA發(fā)生氧化損傷時，線粒體BER同樣需要FEN1修復，亦表明FEN1可在線粒體中存在[21]。

3.2.2蛋白-蛋白相互作用 FEN1通過與蛋白-蛋白相互作用借以參與不同代謝途徑，繼而發(fā)揮其多種生物學功能。Zheng等[1]對 FEN1所參與的蛋白-蛋白相互作用進行廣而深入的研究，其證實FEN1與34種蛋白伴侶相互作用并經歷翻譯后修飾。根據(jù)對FEN1功能的調控作用，此類伴侶蛋白可大致將其分為4個功能類別，其包括了促進岡崎片段成熟的互作蛋白、DNA損傷修復蛋白、凋亡蛋白以及參與FEN1翻譯后修飾的蛋白。

3.2.3翻譯后修飾 FEN1活性的發(fā)揮受到許多翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)調節(jié)，其中包括了磷酸化(phosphorylation)、甲基化(methylation)、乙?；?acetylation)、泛素化(ubiquitination)、SUMO化修飾等等，F(xiàn)EN1通過上述各式PTM途徑的調控并發(fā)揮相應的生物學功能。PCNA作為FEN1功能調控的橋梁之一，F(xiàn)EN1借助與PCNA結合，到達損傷修復或復制的相應位點，進而發(fā)揮相關生化功能，完成后經解離再進行下一循環(huán)。DNA復制過程中，當細胞剛進入S期時FEN1即被甲基化，F(xiàn)EN1受甲基化后結合PCNA，再轉移至DNA復制叉位點，當調控作用完成，F(xiàn)EN1將被磷酸化，F(xiàn)EN1磷酸化后將喪失與PCNA結合的能力，從DNA復制叉脫離，為連接酶進入提供空間。當磷酸化FEN1從DNA解離后，會刺激其發(fā)生SUMO化，繼而引發(fā)泛素化修飾，并最終憑借蛋白酶體途徑發(fā)生降解。此外，UV損傷處理后的細胞會出現(xiàn)FEN1乙?；缴?，F(xiàn)EN1亦可被乙?；揎?，進而避免了FEN1過早處理岡崎片段。應注意的是，上述幾種PTM方式通常是互不干擾、相互交叉進行的：FEN1憑借PTM中的磷酸化修飾所驅動，由核仁轉移到核質，同時，磷酸化又間接影響FEN1與PCNA蛋白互作；另一角度，F(xiàn)EN1-PCNA的結合又間接調控FEN1進入DNA損傷位點或復制的區(qū)室化定位。

4 FEN1與腫瘤的表觀遺傳調控

自20世紀中葉“表觀遺傳學”概念提出以來，經半個多世紀的發(fā)展，表觀遺傳學已從單一學科逐漸演變成基因表達調控、基因組功能與蛋白組學以及腫瘤機制等研究的關鍵領域之一。表觀遺傳調控，是在未涉及DNA序列改變的前提下，通過影響基因表達的一類調控修飾機制，包括甲基化修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA調控以及染色質重塑等[22]，由于表觀遺傳調控具有可逆性的特點，目前，表觀遺傳學異常改變與調控機制依舊是在腫瘤基礎與臨床研究中較新穎的方向。作為表觀遺傳學領域中經典PTM的DNA甲基化，是指DNA中CG二核苷酸序列的胞嘧啶核苷酸5′端在DNA甲基轉移酶催化下，通過添加甲基形成呈簇的“CpG島”以及散在的CpG。CpG島區(qū)域常處于低甲基化狀態(tài)，而正常組織內散在CpG則是高甲基化狀態(tài)。FEN1在多種惡性腫瘤中異常顯著上調，這與腫瘤細胞中FEN1啟動子區(qū)CpG島低甲基化有關。與此同時，SET7能以細胞周期依賴式使FEN1的Lys377發(fā)生單甲基化修飾[23]，而在S期，K377me1則以SET7依賴式上調，當S期結束時下調表達。作為表觀遺傳學另一重要的重要調控機制，目前學術界對于組蛋白修飾中的“乙酰化”研究最為深入。轉錄共激活因子p300的HAT可將FEN1的Lys354、Lys375、Lys377以及Lys380在內的4個賴氨酸殘基乙?；?。此外，亦有學者研究鑒定了FEN1的Lys125、Lys252、Lys254以及Lys314乙?；揎椢稽c[24]，證實上述諸位點突變后，將影響其與DNA底物結合的能力和DNA酶切活性。

5 FEN1靶向抑制劑研究進展

FEN1與腫瘤細胞之間有著雙重關系：FEN1表達上調將有益于維持某些類型腫瘤的克隆、增殖，而在另一角度，F(xiàn)EN1突變或表達下調亦導致基因組不穩(wěn)定，進而促發(fā)新的腫瘤。為此，機體細胞中的FEN1表達水平必須受到嚴格的調控?，F(xiàn)如今，臨床上對于腫瘤疾病常采用標準化療、放療、靶向治療以及生物免疫療法等在內的多種治療手段。值得一提的是，在腫瘤所采用的化療手段中，各類化療藥物一般通過誘導腫瘤細胞DNA發(fā)生損傷，進而引發(fā)腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)抗癌藥性。然而腫瘤細胞DNA修復能力提高會導致耐藥性，故抗癌療效多由DNA損傷、修復之間的平衡所決定的。鑒于FEN1在DNA損傷修復中所發(fā)揮的作用，改變FEN1在腫瘤細胞的表達水平，繼而改變腫瘤細胞對DNA損傷藥物的敏感性是基于FEN1為靶點的抗腫瘤藥物的研發(fā)策略。值得關注的是，F(xiàn)EN1高表達的腫瘤細胞對于替莫唑胺、5-FU、順鉑等DNA損傷藥物具備較強的耐藥性，而FEN1低表達卻使腫瘤細胞對于DNA損傷藥物更為敏感。此外，在細胞水平和動物模型上應用FEN1抑制劑SC13能夠有效抑制DNA復制，誘導其損傷和細胞凋亡，同時增加了抗癌藥物的細胞毒性，有效地抑制了腫瘤的生長，并與其他化療藥物聯(lián)用時，可極大增加其化療敏感性，進而產生較好的抗癌療效[16, 25]。然而仍需面對現(xiàn)實的是，盡管FEN1突變已在人類多種腫瘤標本中檢測到，并被視作引起基因組不穩(wěn)定和腫瘤易感性，但目前對于FEN1缺乏與癌癥易感性之間的確切關系、FEN1基因是否變異以及導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的具體作用機制尚不夠明確，F(xiàn)EN1或將成為腫瘤耐藥與靶向治療研究的新靶點，有待往后更為深入的研究證實。

6 總結與展望

隨著分子生物學、免疫學以及生物信息學等領域研究的不斷深入與發(fā)展，近來陸續(xù)有學者報道并證實FEN1功能失調與腫瘤疾病的關聯(lián)性及其功能調控異常普遍存在于人類多種惡性腫瘤中，F(xiàn)EN1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及臨床診治與預后中的意義也逐漸被闡釋。然而，F(xiàn)EN1在腫瘤細胞中的具體作用機制與生物學功能仍不夠明確：FEN1功能調控靶點與途徑是什么？FEN1在表觀遺傳調控中的機制如何？FEN1在調控網(wǎng)絡中的地位如何呢？目前，已知FEN1的兩個功能性種系rs174538和rs4246215是與腫瘤易感性相關[26]，實際上大多數(shù)對FEN1基因組變異的研究都集中在等位基因頻率大于5%的兩個常見的單核苷酸多態(tài)性上，即啟動子-69G>A(rs174538)和3′UTR 4150G>T(rs4246215)，這兩種基因多態(tài)性均能有效影響FEN1基因組變異[27]，并已證實與機體各器官系統(tǒng)多種腫瘤風險相關，例如消化道惡性腫瘤[28]、肺癌[29]、乳腺癌[30-31]、神經膠質瘤[32]、肝細胞癌[33]、白血病[13, 34]、淋巴瘤[35]以及卵巢癌[36]等。對于上述不同腫瘤疾病，F(xiàn)EN1的作用機制是否相似？FEN1是否介導了某些癌基因及抑癌基因參與表觀遺傳調控，能否將其應用到腫瘤的防治及新型藥物的研發(fā)？在不同腫瘤中的FEN1與其他類型癌基因或抑癌基因的關系如何？FEN1是否參與相關通路進而調控發(fā)揮作用呢？這些問題都值得關注，相信隨著FEN1在多學科領域基礎與臨床的深入研究將有助于用全新的視角去了解腫瘤疾病，進而真正意義上為腫瘤防治與預后評估開拓新的思路。