徐 旺，姚 旭，王元初，史卓堯，王 建，蔣佳樂(lè)，王海紅，曹佳凱，戴晨曦

(江蘇海洋大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

原花青素因其強(qiáng)抗氧化性，被應(yīng)用于美容保健、食品添加劑和化妝品等行業(yè)[1]。原花青素結(jié)構(gòu)決定其所呈現(xiàn)的顏色，因此隨著酸堿性的變化，原花青素的化學(xué)性能和顏色也隨之變化[2-5]。原花青素是熱不穩(wěn)定型色素，受熱極易分解失活[6]，且隨時(shí)間延長(zhǎng)和溫度增加，其分解速度加快。王立志等[7]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，經(jīng)蒸餾萃取得到的原花青素有效成分下降顯著，吸光度低于正常水平[8]。光照是加速原花青素分解的重要因素[9-10]。金屬離子對(duì)原花青素穩(wěn)定性也有密切關(guān)系[11-13]。

原花青素聚合程度對(duì)其生理活性影響很大，低聚原花青素的活性明顯大于高聚原花青素的活性，而高聚體不易被人體吸收[14-15]。從花生紅衣提取物中所得到的原花青素以A型為主，相當(dāng)一部分是以高聚體的形式存在。不同聚合度的原花青素因?yàn)榱u基的作用一般都溶于各種含有羥基的有機(jī)溶劑中，而低聚體溶于水，但聚合度超過(guò)5以上的原花青素難溶于水[16]。所以降低原花青素的聚合度，對(duì)提高花青素的抗氧化性能，增加人體吸收效率有很大作用[17]。

目前國(guó)內(nèi)原花青素的水解方法主要有氧化降解法、酸性降解法、堿性降解法和氫化降解法。其中，氧化降解法和氫化降解法因使用難度較高用得較少。國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄籽高聚原花青素的水解工藝研究較多，這類聚合物以B型結(jié)構(gòu)為主，水解效率較高[18-20]。但對(duì)源自花生紅衣提取物中的高聚原花青素的水解研究較少，主要是因其以A型結(jié)構(gòu)為主，水解較困難[21]。

目前測(cè)定平均聚合度的基本方法是香草醛法[18]，該法以甲醇為溶劑，將水解后的原花青素各黃烷-3-醇單元與香草醛進(jìn)行酚醛縮合反應(yīng)，從而確定原花青素的質(zhì)量濃度。Blutler等[22]采用改良香草醛法研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用冰乙酸作溶劑時(shí)，香草醛只與原花青素黃烷-3-醇末端發(fā)生縮合，由此測(cè)出原花青素的濃度，兩者結(jié)合進(jìn)而求出原花青素的平均聚合度。有學(xué)者曾選用鹽酸、冰醋酸來(lái)水解葡萄籽原花青素高聚體[18-19]，但鹽酸酸性太強(qiáng)，直接將高聚體轉(zhuǎn)化成為花色素，而醋酸酸性太弱，不能完全將原花青素單元間連接鍵打開。魏冠紅[20]選用酸性介于鹽酸與醋酸之間的固體酸性樹脂作為葡萄籽原花青素水解介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，樹脂與高聚體最佳體積比為1∶ 1，70 ℃下水解2 h，在此條件下葡萄籽原花青素的平均聚合度從6.26下降到2.30，下降了3.96個(gè)單位。孫蕓等[23]和Sun等[24]選擇醋酸為溶劑，將香草醛法體系中的鹽酸換成H2SO4，即H2SO4-香草醛法，使產(chǎn)物更單一，減少吸光度測(cè)定偏差。原花青素平均聚合度計(jì)算見(jiàn)式(1)。

mDP=ρ/(CM)

(1)

式中：mDP為平均聚合度；ρ為質(zhì)量濃度，g/mL；C為物質(zhì)的量濃度，mol/mL；M為兒茶素的摩爾分子量，280.94 g/mol。

本研究中，筆者分別用磷酸、檸檬酸和732陽(yáng)離子樹脂等作為水解介質(zhì)，以平均聚合度為指標(biāo)考察水解效果，通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)臈l件，探索花生紅衣原花青素高聚體水解的優(yōu)化工藝。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

乙酸(≥99.5%)，阜寧新苑化工廠；檸檬酸(≥99.8%)，上海試劑一廠；鹽酸(≥99.0%)，南通三江化工有限公司；濃硫酸(≥99.0%)，鄒平天鹿化工有限公司；磷酸(AR,≥85%)、香草醛(≥99.0%)和(+)兒茶素水合物(≥95.0%)，上海阿拉丁實(shí)業(yè)公司；花生紅衣提取物(≥96.0%)，寶雞市森瑞生物化工有限公司；甲醇(≥99.5%)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；732型陽(yáng)離子樹脂，南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 主要儀器

UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；BSA224S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離花生紅衣原花青素高聚物

稱量花生紅衣提取物原花青素1.00 g，加去離子水30 mL，充分?jǐn)嚢枰源龠M(jìn)溶解，室溫下靜置浸泡24 h。將達(dá)溶解平衡的飽和原花青素浸液進(jìn)行抽濾。濾渣在紅外干燥箱60 ℃烘干1 h，稱得濾渣(高聚花青素)質(zhì)量約0.20 g。取一定量濾渣在超聲波作用下溶于甲醇，得到甲醇溶液a；取一定量濾渣在超聲波作用下溶于水得到水溶液b。

1.3.2 原花青素最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

原花青素結(jié)構(gòu)單元黃烷醇A環(huán)具有間苯二酚結(jié)構(gòu)，與香草醛反應(yīng)可生成紅色絡(luò)合物。酸化香草醛與原花青素的反應(yīng)對(duì)光敏感，實(shí)驗(yàn)均在避光條件下進(jìn)行。1 mL(+)-兒茶素乙酸溶液中加入 5 mL 4%鹽酸和0.5%香草醛乙酸溶液，室溫避光反應(yīng)20 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描。

1.3.3 測(cè)量平均聚合度

1)測(cè)定高聚原花青素的質(zhì)量濃度。參照文獻(xiàn)[25]配制系列不同質(zhì)量濃度的(+)-兒茶素水合物甲醇溶液。量取0.5 mL原花青素甲醇溶液a或水溶液b，依次加入2.5 mL 4%香草醛甲醇溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，在500 nm用紫外光掃描測(cè)得吸光度，計(jì)算出溶液a或b中高聚原花青素質(zhì)量濃度。

2)測(cè)定高聚原花青素濃度。參照文獻(xiàn)[25]配制系列不同物質(zhì)的量濃度的(+)-兒茶素乙酸溶液。量取0.5 mL原花青素甲醇溶液a或水溶液b，依次加入0.5 mL 1%香草醛乙酸溶液和2.5 mL 30%硫酸-甲醇溶液，在500 nm用紫外光掃描測(cè)得吸光度，計(jì)算對(duì)應(yīng)的高聚原花青素濃度。

3)計(jì)算原花青素水解溶液的平均聚合度。0.5 mL原花青素水溶液+ 2.5 mL 30 g/L香草醛+ 2.5 mL 30%硫酸，30 ℃避光反應(yīng)20 min后測(cè)定A500。

硫酸-香草醛法測(cè)定原藥青素的平均聚合度。取1 mL(+)-兒茶素乙酸溶液，分別加5 mL 4%硫酸和0.5%香草醛的乙酸溶液，先后在不同溫度、不同時(shí)間反應(yīng)，分別測(cè)定樣品吸光度。計(jì)算原花青素溶液的平均聚合度。

1.3.4 高聚原花青素加酸催化水解

參照文獻(xiàn)[14]考察磷酸、檸檬酸及732型陽(yáng)離子樹脂催化將高聚原花青素水解成寡花青素的效果。然后進(jìn)一步考察不同的水解溫度與水解時(shí)間對(duì)原花青素水解效果的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)(三因素三水平)，以得到較優(yōu)的水解條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素最大吸收波長(zhǎng)

(+)-兒茶素乙酸溶液在鹽酸-香草醛溶液作用下顯色后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描，得到原花青素吸收曲線，其最大吸收波長(zhǎng)為500 nm。

2.2 原花青素的水解條件

通過(guò)高聚原花青素分別加磷酸、檸檬酸和732型陽(yáng)離子交換樹脂催化水解實(shí)驗(yàn)，研究不同溫度和不同時(shí)間對(duì)水解結(jié)果的影響。

2.2.1 不同溫度條件下水解時(shí)間對(duì)平均聚合度的影響

在40～60 ℃條件下，考察不同溫度條件下水解時(shí)間對(duì)原花青素平均聚合度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度條件下水解時(shí)間對(duì)平均聚合度的影響Fig.1 Effects of hydrolysis time on average degree of polymerization of proanthocyanidins under different temperature

由圖1可見(jiàn)：在水解溫度為40～60 ℃時(shí)，不同水解反應(yīng)時(shí)間下，平均聚合度降低最明顯的是732型陽(yáng)離子交換樹脂，達(dá)到2.0～3.0，其水解反應(yīng)能在很短的時(shí)間即可達(dá)到較低的聚合度，但隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，平均聚合度反而逐漸上升；水解效果較差的是檸檬酸，最差的是磷酸。由此可見(jiàn)，花生紅衣高聚原花青素水解程度與催化劑的酸性有一定關(guān)系。但是同時(shí)發(fā)現(xiàn)，并非催化劑酸性越強(qiáng)，高聚原花青素的平均聚合度降低程度越大，因?yàn)闄幟仕岬乃嵝匀跤诹姿幔乖ㄇ嗨亟到饽芰s略高于磷酸，而且檸檬酸和磷酸做催化劑時(shí)，水解反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)水解后原花青素溶液的平均聚合度影響很小。在50 ℃條件下，732型陽(yáng)離子交換樹脂的曲線斜率有所增加，檸檬酸的曲線上移，斜率也有所增加，可見(jiàn)水解溫度的提高，對(duì)平均聚合度的降低不利。在60 ℃條件下，732型陽(yáng)離子交換樹脂的曲線下移，斜率變得平緩，而檸檬酸的曲線上移較明顯，磷酸的催化情況基本不受溫度影響。

曹清麗等[15]以亞硫酸氫鈉為水解介質(zhì)，研究葡萄籽原花青素降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間 90 min、樣品與亞硫酸氫鈉體積比為1∶ 9的條件下，原花青素的平均聚合度為從4.6降為2.3。趙平等[16]研究發(fā)現(xiàn)，亞硫酸作為酸介質(zhì)對(duì)葡萄籽原花青素水解后的平均聚合度最大下降了3.54。從亞硫酸和亞硫酸氫鈉為水解介質(zhì)的情況看，前者酸性大于后者(也大于磷酸)，水解效果也更好。而本研究使用732型陽(yáng)離子交換樹脂作為花生紅衣原花青素水解介質(zhì)，在40 ℃，僅用約10 min即可達(dá)到類似效果。

2.2.2 水解溫度對(duì)原花青素平均聚合度的影響

考察水解時(shí)間為10～30 min時(shí)，不同水解溫度對(duì)原花青素平均聚合度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同水解時(shí)間條件下水解溫度對(duì)原花青素平均聚合度的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on the average degree of polymerization of proanthocyanidins at different times

由圖2可知：水解反應(yīng)10 min后，曲線在不同反應(yīng)溫度下732型陽(yáng)離子交換樹脂催化的平均聚合度出現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)；檸檬酸催化效果呈逐漸上升趨勢(shì)而磷酸催化效果呈直線趨勢(shì)。因此隨著溫度的提高，732型陽(yáng)離子交換樹平均聚合度降低越明顯，磷酸催化效果變化不大，檸檬酸的催化效果降低，且磷酸和檸檬酸的催化效果更為接近；水解反應(yīng)15 min后，溫度的影響已基本不變。

在同一溫度條件下，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸和檸檬酸催化水解的平均聚合度一直在5.0左右，變化不大。在60 ℃時(shí)，732型陽(yáng)離子樹脂催化水解的平均聚合度降至2.5左右。由此可見(jiàn)，732型陽(yáng)離子樹脂為水解反應(yīng)催化劑有利于降低原花青素平均聚合度。初步確定較好反應(yīng)時(shí)間為15 min，反應(yīng)溫度為60 ℃。另外，過(guò)高的催化劑與高聚原花青素溶液體積比在反應(yīng)時(shí)，可能因酸過(guò)多導(dǎo)致原花青素形成花色素，也會(huì)影響水解效果。因此，在單因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 正交設(shè)計(jì)(三因素三水平)優(yōu)化水解條件

設(shè)計(jì)原花青素甲醇溶液與732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂的體積比、水解溫度和時(shí)間這3個(gè)因素，設(shè)置3個(gè)不同水平，對(duì)水解反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1和表2可知，3個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響次序大小依次為體積比、水解時(shí)間、水解溫度。因此，優(yōu)先考慮原花青素甲醇溶液與陽(yáng)離子樹脂溶液的體積比，其次考慮水解時(shí)間，最后考慮反應(yīng)溫度對(duì)水解實(shí)驗(yàn)的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

3 結(jié)論

1)以平均聚合度為指標(biāo)，考察磷酸、檸檬酸及732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂等不同類型酸性介質(zhì)、原花青素甲醇溶液與陽(yáng)離子樹脂的體積比、水解溫度和時(shí)間等對(duì)水解反應(yīng)的影響。采用硫酸-香草醛法測(cè)定水解后原花青素平均聚合度。結(jié)果表明，在相同條件下，732型陽(yáng)離子樹脂是最適宜的水解催化劑。

2)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得到優(yōu)化的水解反應(yīng)條件：原花青素甲醇溶液與陽(yáng)離子樹脂的體積比為2.0∶ 1，水解溫度60 ℃下，反應(yīng)15 min。原花青素高聚體的平均聚合度最低可降至2.55，有效降低了花生紅衣原花青素的平均聚合度。