冀成法，馬魯南，柳常青，滕學(xué)東，邵明學(xué)，劉 忠，張貴民

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；2.魯南新時代生物技術(shù)有限公司，山東 臨沂 273400；3.山東新時代藥業(yè)有限公司 山東省蛋白類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 273400)

腦卒中又叫腦中風(fēng)，是由各種不同病因引起的腦部血管性疾病，是我國成年人致死、致殘的首位病因，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是導(dǎo)致老年人死亡的最常見三大疾病(腦血管病、冠心病、腫瘤)之一。數(shù)據(jù)顯示，2017年我國約有 196 萬人死于腦卒中[1]。重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是應(yīng)用基因工程技術(shù)設(shè)計的一種新型蛋白藥物，屬于治療用生物制品Ⅰ類新藥。該蛋白具有多重功效，包括抑制白細(xì)胞活化、遷移、黏附功能，抑制凝血酶活性，能與纖維蛋白結(jié)合，從而達(dá)到治療腦卒中的目的[2]。TNHH由280個氨基酸組成，N末端含257個氨基酸的NIF，C末端含20肽水蛭肽(hirulog)，中間由短鏈氨基酸交鏈區(qū)組成，TNHH結(jié)構(gòu)中，NIF區(qū)域與天然的NIF差異1個氨基酸，而其中水蛭肽與文獻(xiàn)[3]報道的hirulog有2個氨基酸差異。

重組大腸桿菌的生長受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響，其中影響較大的有培養(yǎng)基組成、pH、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和補(bǔ)料方式等[4-7]。根據(jù)TNHH工程菌的生長特性，結(jié)合包涵體產(chǎn)量，優(yōu)化培養(yǎng)基組成及補(bǔ)料流加方式，以減少碳源的抑制[8-9]，控制合適的比生長速率，選擇在適宜的密度誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)TNHH工程菌的高密度高表達(dá)。鑒于誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)毒性較大、成本較高，而乳糖作為二糖，無毒、價廉，本身可以作為碳源使用，是一種較佳的IPTG替代物，目前已有不少基因工程菌利用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)的報道[10-11]，筆者對此進(jìn)行了對比研究。隨著國家藥品監(jiān)督管理局對制藥行業(yè)抗生素使用的監(jiān)管趨嚴(yán)，《中國藥典》明確規(guī)定青霉素類抗生素禁止在生產(chǎn)過程中使用。為此，本研究還考察了工藝放大過程中抗生素對發(fā)酵結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株

TNHH表達(dá)菌株E．coliBL21(DE3)/pET12a-TNHH，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(質(zhì)粒構(gòu)建見圖 1)和保存。

圖1 表達(dá)重組質(zhì)粒pET12a-TNHH的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pET12a-TNHH

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：配方參照文獻(xiàn)[12]。

LA培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入氨芐西林鈉(Amp)溶液。

發(fā)酵培養(yǎng)基(M9-YE-Gly)：0.3%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.06%NaCl、0.5%KH2PO4、3%Na2HPO4·12H2O、2%甘油、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl。

補(bǔ)料：50%甘油、5%蛋白胨、3%酵母膏。

以上都是質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

所有培養(yǎng)基均用氨水調(diào)節(jié)pH到7.0，各培養(yǎng)基均加入氨芐西林鈉溶液至0.1 g/L。

1.3 儀器設(shè)備

5 L多聯(lián)玻璃發(fā)酵罐、50 L發(fā)酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司；LYNX 6000型高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司；DM750型顯微鏡，徠卡公司；Ultrospec 2100 pro型紫外分光光度計，GE公司。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

甘油管菌種劃線接種至固體LB斜面上，37.0 ℃培養(yǎng)12～15 h，挑取種子斜面菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，37.0 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600為 0.5～0.8，得活化種子液。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的活化種子液按1%接種量接入含200 mL M9-YE-Gly培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～15 h。

表1 培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

1.4.3 分批補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵采用5 L和50 L發(fā)酵罐，初始發(fā)酵體積為發(fā)酵罐體積的60%，按發(fā)酵初始體積的10%接種量接入搖瓶種子液，發(fā)酵溫度為37 ℃。整個發(fā)酵過程通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通入純氧控制溶氧在30%～60%。當(dāng)培養(yǎng)基中養(yǎng)料耗盡，溶氧和pH同步上升后，采用指數(shù)流加的方式補(bǔ)料。待OD600達(dá)到40，加入適當(dāng)濃度的誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計繼續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體密度測定

采用紫外分光光度計測定600 nm波長處的光密度，用OD600表示。

1.5.2 TNHH蛋白表達(dá)量的測定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)參照文獻(xiàn)[13]，采用凝膠處理系統(tǒng)分析目的蛋白表達(dá)量。

1.5.3 質(zhì)粒丟失率檢測

TNHH工程菌的表達(dá)質(zhì)粒帶有氨芐抗性基因，在菌體傳代過程中，在一定濃度的抗生素環(huán)境下，質(zhì)粒丟失后菌體便不能存活，而在不含抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)液中，隨著傳代代次的提高，可能有部分大腸桿菌丟失了質(zhì)粒，失去了抗生素抗性基因，也同時失去表達(dá)目的蛋白的能力。通過比較在含有或不含抗生素培養(yǎng)基的菌體存活數(shù)，可以檢測質(zhì)粒的丟失率，考察發(fā)酵過程的質(zhì)粒穩(wěn)定性。

發(fā)酵過程取樣，測定菌體密度，取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的菌液涂布于不含氨芐西林鈉的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h，用無菌牙簽隨機(jī)挑取100個單菌落分別接種于含氨芐西林鈉的LA平板和LB平板上， 37 ℃培養(yǎng)15 h。統(tǒng)計2種平板長出的菌落數(shù)目，按式(1)計算。

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.1.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組分

通過田口試驗(yàn)設(shè)計方法重點(diǎn)考察合成培養(yǎng)基中碳、氮源不同的濃度水平，進(jìn)行酵母膏(Y)、蛋白胨(T)、NH4Cl(N)、甘油(G)四因素三水平試驗(yàn)(表1)，圖2所示為9組試驗(yàn)搖瓶的SDS-PAGE電泳表達(dá)情況，TNHH理論分子量3.1×104～3.5×104，箭頭所指示的條帶即為目的表達(dá)條帶。經(jīng)Minitab軟件分析，確定了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基組成Y2T2N3G1，提高并穩(wěn)定外源蛋白的表達(dá)量在30%以上。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1～9—9組搖瓶試驗(yàn)的TNHH圖2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化的SDS-PAGE分析電泳表達(dá)圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the optimization results of culture medium

2.1.2 溫度對工程菌生長的影響

選擇不同培養(yǎng)溫度(30、35、37、39、42和45 ℃)條件下，150 r/min培養(yǎng)4 h后，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：在30 ℃時，工程菌的生長速度顯著慢于其他溫度，在接種后6 h生長速度隨著溫度的升高逐步加快，6 h以后工程菌生長速度趨于一致。在45 ℃培養(yǎng)6 h后工程菌生長速度開始減慢，同時在45 ℃培養(yǎng)14 h后生長速度也有下降趨勢，推斷高溫使工程菌代謝負(fù)荷加重，影響胞內(nèi)酶系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，從而使工程菌過早老化所致。由此可知，35～39 ℃是工程菌生長的最適溫度，是比生長速率達(dá)到最大值的溫度范圍。

圖3 溫度對工程菌生長的影響Fig.3 Effects of temperatures on cell growth

2.1.3 pH對工程菌生長的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 h后，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵過程取樣測OD600，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：不同pH條件下，菌體生長的延遲期均在3 h左右，其中，pH為6.8～7.5時，菌體對數(shù)生長期持續(xù)到6～7 h。在對數(shù)生長期內(nèi)，工程菌在pH6.0時生長速度最慢，其次是pH8.0、7.5和6.5；而pH為6.8～7.5時，在7 h內(nèi)的菌體生長速度基本相同，在7 h后隨著pH的升高，生長速度呈同步上升趨勢。由于工程菌在生長過程中會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物(如乙酸、乳酸等)，搖瓶培養(yǎng)無法調(diào)控pH，這使培養(yǎng)基的pH不斷下降，而pH為7.5時，工程菌在7 h后仍能保持較快的生長速度。由此可知，過低的pH(pH6.5以下)和過高的pH(pH7.5以上)都會抑制工程菌的生長，工程菌的最適生長pH為6.8～7.5。

圖4 pH對工程菌生長的影響Fig.4 Effects of pH on cell growth

2.1.4 誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間對工程菌生長和目的蛋白表達(dá)的影響

搖瓶培養(yǎng)5 h后，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4和1.0 mmol/L的IPTG，0.1、0.5和1.0 g/L乳糖誘導(dǎo)10 h，發(fā)酵結(jié)束取樣測蛋白表達(dá)量，結(jié)果如表2和圖5所示。由表2和圖5可知：不同IPTG濃度對表達(dá)量影響不大，而不同乳糖濃度對表達(dá)量有一定影響，IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)效果優(yōu)于乳糖。加入IPTG和乳糖都會對工程菌的生長有顯著抑制，但乳糖的抑制作用弱于IPTG，這可能與IPTG的毒性有關(guān)。綜合考慮成本及高密度發(fā)酵，優(yōu)選0.2～0.4 mmol/L IPTG為誘導(dǎo)劑。乳糖雖然搖瓶試驗(yàn)誘導(dǎo)效果不及IPTG，但1.0 g/L乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)量仍能達(dá)到25.6%，其無毒、價格低廉，可以考慮在發(fā)酵罐放大階段進(jìn)一步優(yōu)化以替代IPTG作為誘導(dǎo)劑。

表2 不同誘導(dǎo)劑濃度對工程菌發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖5 誘導(dǎo)劑濃度與誘導(dǎo)時間對工程菌生長影響Fig.5 Effects of inducer concentration and induction time on cell growth

2.2 發(fā)酵罐結(jié)果

大腸桿菌高密度發(fā)酵最大的難題和障礙是乙酸的生成[14-15]，基于此，在不同的時間流加同等量的補(bǔ)料以保證菌體正常生長，可一定程度上降低乙酸的生成。誘導(dǎo)劑的加入會顯著抑制工程菌的生長，如果在較低的菌體密度下誘導(dǎo)，會導(dǎo)致最終發(fā)酵密度偏低，就無法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，而在過高的菌體密度下進(jìn)行誘導(dǎo)，可能會導(dǎo)致誘導(dǎo)后期菌體自溶或表達(dá)量偏低。因此，發(fā)酵誘導(dǎo)時機(jī)也是高密度發(fā)酵需要考慮的重要因素。由于TNHH工程菌具有氨芐抗性，在發(fā)酵過程中添加Amp能有效抑制質(zhì)粒丟失工程菌的生長，在一定程度上提高發(fā)酵表達(dá)量，但《中國藥典》明確規(guī)定青霉素類抗生素禁止在生產(chǎn)過程中使用，因此應(yīng)考察非抗生素選擇壓力下發(fā)酵過程的質(zhì)粒丟失情況，以保證生產(chǎn)過程的穩(wěn)定。

2.2.1 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

在搖瓶試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，在5 L發(fā)酵罐中采用分批補(bǔ)料的方式發(fā)酵生產(chǎn)TNHH融合蛋白。以改良培養(yǎng)基為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量5%～10%，控制溫度37 ℃，溶氧不低于30%。優(yōu)化補(bǔ)料量和補(bǔ)料時間，待培養(yǎng)基主要碳源基本耗盡，加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后補(bǔ)料時間控制在4、6和8 h，過程中取樣檢測菌體密度和表達(dá)量，發(fā)酵結(jié)果如圖6和7所示。由圖6和7可知：隨著補(bǔ)料時間的延長，OD600從36.34提高至62.30；包涵體質(zhì)量從7.3 g提高至18.8 g，提高了258%。隨著補(bǔ)料時間的進(jìn)一步延長，目的蛋白表達(dá)量均同步增加，可見增加補(bǔ)料量并延長誘導(dǎo)時間均有利于菌體密度的提高和目的表達(dá)產(chǎn)物的積累。

圖6 補(bǔ)料量和補(bǔ)料時間對工程菌OD600的影響Fig.6 Effects of feed quantity and feed time on OD600

圖7 補(bǔ)料量和補(bǔ)料時間對工程菌發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of feed quantity and feed time on fermentation

2.2.2 50 L發(fā)酵罐中試發(fā)酵

基于以上試驗(yàn)結(jié)果，筆者確定了50 L發(fā)酵罐中試發(fā)酵方案：采用半合成培養(yǎng)基，溶氧30%左右，pH6.8～7.5，接種后37 ℃培養(yǎng)6～8 h，待養(yǎng)料耗盡，恒速流加補(bǔ)料1～2 h，待培養(yǎng)基主要碳源基本耗盡，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)指數(shù)流加補(bǔ)料誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，結(jié)果如表3所示。由表3可知：發(fā)酵的前一階段，工程菌的生長速率很高，但隨后工程菌生長趨于緩慢；工程菌最終的OD600在79以上，表達(dá)量維持在30%以上，質(zhì)粒丟失率保持在10%以內(nèi)。

表3 50 L發(fā)酵罐結(jié)果

3 結(jié)論

為實(shí)現(xiàn)TNHH的高密度發(fā)酵和高效表達(dá)，首先利用搖瓶試驗(yàn)對單因素逐一優(yōu)化，隨后優(yōu)化補(bǔ)料流加策略，通過5 L發(fā)酵罐試驗(yàn)確定了最適宜的培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)溫度35～39 ℃、pH 6.8～7.5、誘導(dǎo)劑濃度0.2～0.4 mmol/L IPTG，通過優(yōu)化后的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝進(jìn)行50 L發(fā)酵放大，符合預(yù)期。通過搖瓶試驗(yàn)對比了IPTG和乳糖對發(fā)酵誘導(dǎo)的影響，乳糖效果不及IPTG，但其價廉、無毒，仍可以作為一種備選的誘導(dǎo)劑。通過不同的補(bǔ)料時間流加等量的補(bǔ)料，獲得了相對較佳的補(bǔ)料速度和誘導(dǎo)時間，控制工程菌的比生長速率，從而實(shí)現(xiàn)菌體密度的提高和目的表達(dá)產(chǎn)物的積累。

采用構(gòu)建的TNHH中試發(fā)酵工藝，在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵6批，無論是否添加抗生素，各批發(fā)酵結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，最終菌體密度OD600均能達(dá)到79以上，目的蛋白表達(dá)量30%以上，發(fā)酵結(jié)束時的質(zhì)粒丟失率保持在10%以內(nèi)。通過一系列的發(fā)酵參數(shù)及補(bǔ)料控制等過程優(yōu)化，摸索出了較佳的發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝控制策略，發(fā)酵產(chǎn)量提高258%，在獲得TNHH高產(chǎn)的同時保證了較低的質(zhì)粒丟失率。本研究為該項(xiàng)目后續(xù)GMP生產(chǎn)的工藝控制與偏差管理提供了理論與技術(shù)支持，并對TNHH的商業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)及推廣具有重要的技術(shù)指導(dǎo)意義。