邱婷，占凌輝，陸程翔

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1、重癥醫(yī)學(xué)科2，福建 廈門 361004

細(xì)胞焦亡是一種新近研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式。它以伴隨著大量炎癥因子的釋放為特征，能夠誘發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)。在多種炎癥性疾病中已顯示出與炎癥反應(yīng)的持續(xù)加重及不良預(yù)后有關(guān)[1-3]。既往認(rèn)為，在急性胰腺炎中通常存在大量的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。近年來的研究顯示，這些被檢測出的凋亡細(xì)胞事實上有相當(dāng)一部分其實是焦亡的細(xì)胞[4]。但是細(xì)胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況目前仍不清楚。本研究旨在探討caspase-1依賴性腺泡細(xì)胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況，為臨床治療急性胰腺炎提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 動物選擇與分組 健康成年Wistar大鼠12只，體質(zhì)量160～180 g。采用隨機數(shù)表法將其分為對照組和胰腺炎組，每組6只。

1.2 模型制備及處理 實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。胰腺炎組大鼠分2次腹腔內(nèi)注射20%L-精氨酸溶液(2×100 mg/100 g)，間隔1 h。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水(1.0 mL×2)。

1.3 光鏡蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察胰腺組織病理學(xué)變化 造模成功后24 h，兩組大鼠采血后處死，經(jīng)腹腔分離切取胰腺組織塊，常規(guī)石蠟包埋。將石蠟包埋的胰腺組織切片，行HE染色，在光鏡下觀察胰腺組織學(xué)改變。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測腺泡細(xì)胞caspase-1、GSDMD表達(dá)情況 胰腺組織塊以裂解液進行裂解。用BCA法測定蛋白質(zhì)含量。之后稀釋樣本至2μg/μL。取40μg樣品行SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白樣品轉(zhuǎn)印到PVDF膜上并加入兔一抗封閉過夜(GSDMD：Abcam公司；caspase-1：碧云天)。次日5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，羊抗兔ΙgG(H+L)HRP(GSDMD：abcam公司；caspase-1：碧云天)反應(yīng)。實驗中以β-actin(Abcam公司)作為內(nèi)參照。繼以ECL反應(yīng)后顯影、定影。用Quantity One軟件進行定量測定(v4.62版本)。結(jié)果以待測蛋白與內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 血清標(biāo)本采集與處理 各組于模型制作成功后24 h經(jīng)尾靜脈采集靜脈血，室溫下，離心并取上清液于-70℃保存。以ELΙSA測定血清白介素-1β(ΙL-1β)、白介素-18(ΙL-18)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)。所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)間比較采用t檢驗，相關(guān)分析采用Person相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠胰腺組織的病理學(xué)改變 胰腺炎組大鼠的胰腺肉眼大體觀可見：胰腺組織明顯水腫，顏色暗紅，未見到明顯的出血及壞死表現(xiàn)。鏡下病理變化較輕微，主要是以間質(zhì)水腫、空泡形成以及炎性浸潤為主。對照組則無明顯病理改變，見圖1。

圖1 胰腺組織的病理學(xué)改變(×200)

2.2 兩組大鼠腺泡細(xì)胞活化caspase-1、GSDMD表達(dá)水平比較 與對照組比較，胰腺炎組的活化caspase-1及GSDMD表達(dá)水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

組別對照組胰腺炎組t值P值例數(shù)6 6 caspase-1 0.20±0.02 0.59±0.04 19.221＜0.05 GSDMD 0.23±0.02 0.58±0.08 9.947＜0.05

2.3 兩組大鼠的血清ΙL-1β、ΙL-18水平比較 胰腺炎組大鼠血清ΙL-1β和ΙL-18明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠血清IL-1β、IL-18比較(±s，pg/mL)

表2 兩組大鼠血清IL-1β、IL-18比較(±s，pg/mL)

組別對照組胰腺炎組t值P值例數(shù)6 6 ΙL-1β 24.34±4.52 115.14±13.12 16.028＜0.05 ΙL-18 21.67±3.98 185.91±14.72 26.375＜0.05

2.4 caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相關(guān)性 應(yīng)用Pearson相關(guān)分析法檢驗胰腺組織活化caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，胰腺組織活化caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平均有顯著的正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.979和0.974，P＜0.01)。

3 討論

急性胰腺炎作為一種常見的急重癥，其病情兇險多變，它的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸一直是臨床醫(yī)學(xué)研究的重點之一。急性胰腺炎發(fā)病機制上，通過胰酶的激活、大量的細(xì)胞因子和氧自由的產(chǎn)生造成腺泡細(xì)胞的損傷,這些受到損傷的腺泡細(xì)胞進一步在多種炎癥介質(zhì)的作用下發(fā)生胞膜破裂以及更多的炎癥因子釋放，最終形成放大式的炎癥反應(yīng)加重。通常胰腺腺泡細(xì)胞的損傷可以出現(xiàn)凋亡、自噬、焦亡和壞死等多種死亡結(jié)局。細(xì)胞焦亡是較新發(fā)現(xiàn)的一種受調(diào)控的程序性的細(xì)胞死亡方式[5]。細(xì)胞焦亡發(fā)生時，有較多的微小孔隙在細(xì)胞膜上形成并導(dǎo)致細(xì)胞膜的受損,進而使得細(xì)胞膜兩側(cè)的離子梯度消失，炎性物質(zhì)從胞內(nèi)釋放到胞外，細(xì)胞間液流入胞內(nèi)，最終細(xì)胞出現(xiàn)腫脹破裂。與這一過程同時發(fā)生的還有細(xì)胞核的濃縮以及隨機降解和斷裂的染色體DNA。與凋亡的不同之處在于焦亡細(xì)胞雖然也有發(fā)生核固縮，但其細(xì)胞核能夠保持完整，而不發(fā)生核裂解[6-7]。

隨著對焦亡的研究深入，已有諸多線索提示腺泡細(xì)胞焦亡在急性胰腺炎中可能發(fā)揮重要的作用。比如，通過新的檢測手段能區(qū)分出在急性胰腺炎中用TUNEL法檢測出來的凋亡細(xì)胞中是混有雜有許多焦亡細(xì)胞的；在胰腺炎的標(biāo)本中明確檢測出活化caspase-1陽性表達(dá)；在caspase-1基因缺乏大鼠制作的急性胰腺炎中觀察到明顯的降低的炎癥的程度[8-9]；在用雨蛙素腹腔注射制作的大鼠急性胰腺炎模型中觀察到ΙL-1β前體的mRNA水平出現(xiàn)明顯的增高[10]；急性胰腺炎患者血清中ΙL-1水平也明顯高于正常人群[11-12]。研究普遍認(rèn)為凋亡減輕炎癥反應(yīng)而焦亡促進炎癥反應(yīng),對疾病的轉(zhuǎn)歸影響截然不同。但是，目前對于細(xì)胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況尚不明確。

新近的研究結(jié)果表明焦亡所依賴的caspase-1在急性胰腺炎炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮的作用不容忽視。焦亡過程中ΙL-1β前體需要在caspase-1的作用下方能轉(zhuǎn)化為有活性的ΙL-1β進而釋放至胞外發(fā)揮作用。誘導(dǎo)caspase-1基因表達(dá)或者caspase-1基因缺乏均可以影響急性胰腺炎大鼠的炎癥程度[8-9]。近年來對于GSDMD的深入研究認(rèn)為Pro-caspase-1有切割GSDMD的作用。Caspase-1前體在被激活之后能夠?qū)SDMD進行切割，終致啟動細(xì)胞焦亡[13-14]。GSDMD作為caspase-1的作用底物，在被其切割后形成的氮端肽段是發(fā)生細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵步驟。敲除GSDMD基因能夠使細(xì)胞焦亡受到阻斷，細(xì)胞最終發(fā)生凋亡?；贕SDMD在焦亡中的這一重要地位，目前普遍認(rèn)為，能否驗證GSDMD的活化是證實細(xì)胞發(fā)生焦亡的重要依據(jù)之一。在本研究中，活化caspase-1指標(biāo)明顯增高，并且GSGDM也出現(xiàn)明顯增高，這些結(jié)果反映了在急性胰腺炎中存在明顯的caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡現(xiàn)象。并且這種焦亡形式在急性胰腺炎的炎癥發(fā)展中起著某種重要的作用。

目前已知，經(jīng)典焦亡途徑是caspase-1介導(dǎo)的需炎癥小體參與的通路。各種損傷信號經(jīng)過傳導(dǎo)而作用于炎性小體，使得caspase-1活化，終致細(xì)胞膜上形成孔洞，同時ΙL-1β和ΙL-18前體也被活化并釋放出細(xì)胞，能夠造成炎性細(xì)胞的黏附、聚集，放大組織炎癥反應(yīng)，這是細(xì)胞焦亡發(fā)生的主要機制[15-16]。其具體的過程，目前認(rèn)為是炎性小體通過其所包含的接頭蛋白ASC以CARD-CARD和PYD-PYD相互作用結(jié)合的形式，把caspase-1和炎性小體以類似橋梁的形式銜接在一起，這樣caspase-1前體被活化，并且可以作用于ΙL-1β和ΙL-18前體使其得以激活[17-18]。這樣在細(xì)胞焦亡的同時，出現(xiàn)了瀑布式的炎癥反應(yīng)。已有學(xué)者的研究證實，在急性胰腺炎早期階段ΙL-1β及ΙL-18就出現(xiàn)明顯的升高，并且在整個病情進展過程中始終保持著較高的水平[19]。在研究中，可以發(fā)現(xiàn)血清ΙL-β和ΙL-18表達(dá)出現(xiàn)顯著增高，并且相關(guān)性證實caspase-1的活化與血清ΙL-β和ΙL-18的增高之間呈顯著正相關(guān)性。這更增加了caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡存在的證據(jù)。因此，也有理由相信，綜合caspase-1、GSDMD和ΙL-1β和ΙL-18的顯著活化情況可能是反映腺泡細(xì)胞焦亡程度的一個預(yù)測指標(biāo)，對于判斷急性胰腺炎的預(yù)后有重要的意義。

本研究未就細(xì)胞焦亡的病理表現(xiàn)進行深入的研究，其與caspase-1依賴的GSDMD活化的相關(guān)性尚不清楚。這一途徑是否還存在其他形式的激活通路，能否通過抑制這一焦亡途徑來實現(xiàn)抑制胰腺炎的發(fā)生及發(fā)展？這些還需要進一步的研究探討。